Boc5对脑缺血再灌注小鼠血脑屏障损伤的保护作用

李纪宏，刘晨旭，冯颖达，孙 阳，李小强，张慧楠

(1.空军军医大学药学系药理学教研室，西安 710032；2.国家中医药管理局中药胃肠药理重点研究室，西安 710032)

脑卒中是严重威胁人类生命健康的重大疾病[1-2]。寻找并开发新的具有神经保护作用的药物对于减轻脑缺血再灌注损伤(CIRI)具有重要的临床意义[3-4]。星形胶质细胞是脑中数量最多的细胞，通过药物干预减轻星形胶质细胞炎症释放是改善CIRI预后的有效治疗策略[5-7]。

胰高血糖素样1受体(GLP-1R)属于G蛋白偶联受体，在心脏、肾脏、肝脏和脑等重要器官中均有表达[8-9]。脑内GLP-1R激动能够抑制神经细胞凋亡，减轻炎症损伤[10-11]。目前在临床上应用的GLP-1R激动剂均只能注射给药[12]。Boc5 (C54H52N4O16S2)是通过高通量筛选的方法在48 600个小分子化合物库中筛选得到的具有口服活性的GLP-1R小分子激动剂[13]。既往实验结果表明，Boc5能够通过激活GLP-1R降低血糖[14-15]，但其对CIRI的保护作用目前尚无报道，本研究通过小鼠大脑中动脉栓塞再灌注(MCAO/R)模型探讨其作用及机制。

1 仪器与材料

1.1仪器 SZM45型体式显微镜，宁波舜宇仪器有限公司；HC-X803型显微精细镊，宁波市成和显微器械厂；紫外分光光度计，美国Bio-Rad公司；FV1000型激光扫描共聚焦显微镜，日本Olympus公司；Tanon-4200型化学发光成像分析系统，上海天能科技有限公司。

1.2试药 Boc5，美国TargetMol Boston公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，美国Sigma公司；多聚甲醛溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)，均购自北京里根生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和过氧化氢酶(CAT)试剂盒，均购自南京建成科技有限公司；抗闭合蛋白、紧密连接蛋白-5单克隆抗体、二抗，均购自美国Cell Signaling Technology公司；TUNEL染色试剂盒，北京四正柏生物科技有限公司。

1.3实验动物 成年雄性C57BL/6J小鼠，体质量为18～22 g，购自空军军医大学动物中心。在温度为25±2 ℃、相对湿度为50%～70%的条件下饲养，12 h明暗交替。

2 方法

2.1MCAO/R模型的建立 参照文献方法[16]。将C57BL/6J小鼠用10 mg·mL-1戊巴比妥钠麻醉，沿颈部正中剪开皮肤，钝性分离皮下组织和肌肉，分离出颈总、颈外和颈内动脉，栓线自颈内动脉穿入，经颈总动脉栓塞大脑中动脉，60 min后拔出栓线模拟再灌注过程。

2.2动物分组及处理 将75只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、模型组和Boc5高、中、低剂量(10.0、5.0、2.5 μmol·kg-1)组，每组15只。Boc5高、中、低剂量组连续灌胃给药7 d后行MCAO/R损伤；模型组给予等体积的生理盐水7 d后行MCAO/R损伤。

2.3神经功能缺陷评分 MCAO/R损伤24 h后，分别在各组小鼠中随机取8只，按照改良神经功能损害评分法(mNSS)评价神经功能损伤情况[17-18]，其中提尾实验3分，行为功能评分3分，感觉实验评分2分，平衡木实验6分，反射评分4分，总分为18分，总分越高，表示行为缺陷越严重。

2.4足误实验及转棒实验 神经功能缺陷评分后随即进行足误实验及转棒实验[19-20]。足误实验旨在评价左前肢功能，将小鼠放在带网格的格子架上(长×宽×高：40 cm×20 cm×30 cm)，计数小鼠左前爪错误次数和右前爪总步数；转棒实验旨在评价运动协调能力。MCAO/R损伤前每日对各组小鼠进行1次训练，共3 d，MCAO/R损伤测定小鼠转棒停留时间。

2.5生化指标检测 MCAO/R损伤24 h后，分别在各组小鼠中取6只，眼眶取血，分离血清，按照试剂盒说明书检测SOD、MDA和CAT水平。

2.6TTC染色 各组分别取5只小鼠，处死，取脑，用TTC染色法计算梗死面积[21]。将脑组织置于-20 ℃环境下冷冻0.5 h，冠状切面(2 mm·片-1)；将脑片置于TTC溶液(20 mg·mL-1)中，37 ℃孵育0.5 h，不断翻动脑片，确保染色均匀；多聚甲醛(40 mg·mL-1)固定12 h，拍照，用Photoshop计算梗死面积百分比。

2.7原代星形胶质细胞的培养 参照文献方法[22]，取新生1 d的幼鼠，酒精浸泡消毒后置于冰浴D-Hank′s平衡液的灭菌皿中，精细镊取全脑置于另一灭菌皿中；剥离软脑膜，夹碎皮层；加入10 mg·mL-1胰蛋白酶1.5 mL，置于37 ℃恒温培养箱中消化30 min；离心管中将细胞吹打至混悬；200目筛网过滤；置于37 ℃培养箱中培养14 d，每3 d换液1次。

2.8氧糖剥夺损伤/复氧 (OGD/R) 损伤 参考文献方法[23]，用PBS冲洗细胞3次，置于无糖DMEM培养基中培养，并在无氧气体(94%氮气+6%二氧化碳)的密闭室内培养6 h；损伤6 h后换回含血清DMEM培养基[24]，置于正常氧环境中培养24 h。

2.9血脑屏障通透性测定 伊文氏蓝法检测血脑屏障通透性[25-26]。MCAO/R后，分别在各组中取4只小鼠，尾静脉注射20 mg·kg-1伊文氏蓝，2 h后过量麻醉处死小鼠，取缺血侧脑组织称定质量后置于EP管中，加入甲酰胺3.0 mL，55 ℃避光孵育24 h，用紫外分光光度计在630 nm波长处检测吸光度值A，结果表示为A·g-1湿脑组织。

2.10酶联免疫吸附 (ELISA) 法检测炎性因子水平 采用试剂盒检测炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6 (IL-6)的水平。取星形胶质细胞培养液的上清液，4 ℃条件下以1 000 r·min-1离心5 min；加入到包被抗小鼠IL-1β、TNF-α和IL-6单抗的酶标板上；每孔分别加入酶标抗体液100 μL，混匀后置于37 ℃孵箱内孵育1 h；洗涤酶标板，甩干水分；每孔再分别加底物工作液100 μL，置于37 ℃孵箱中避光反应10 min，显色；每孔各加入50 μL终止液终止反应；置于酶标仪上测定各孔在490 nm波长处的吸光度值A。

2.11Western Blot实验 MCAO/R后，分别在各组中取4只小鼠过量麻醉处死小鼠，取缺血半暗区组织，加入100 μL蛋白裂解液，冰上超声，以13 000 r·min-1离心15 min，取上清液；蛋白质定量(BCA)法测定蛋白浓度；加上样缓冲液40 μg，煮沸5 min，电泳分离、转膜，以0.05 g·mL-1脱脂奶粉封闭60 min，加一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育12 h，TBST洗涤3次，加二抗(1∶5 000稀释)，室温孵育60 min，用TBST洗涤3次，ECL显色，Bio Rad凝胶成像系统拍照，Quantity One软件对Western Blot条带进行灰度分析。

2.12统计学方法 2组间比较采用Student'st检验；多组间比较先进行方差分析后进行Dunnettt检验；P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1Boc5对MCAO/R所致小鼠行为缺陷的影响 见表1。由表1可知，与模型组比较，Boc5中、高剂量组神经缺陷评分和足误率显著改善，转棒停留时间明显延长。实验结果表明，Boc5能改善MCAO/R所致的小鼠行为学损伤。

表1 Boc5对MCAO/R所致小鼠行为缺陷的影响

3.2Boc5对MCAO/R后生化指标的影响 见表2。由表2可知，与模型组比较，Boc5低、中、高剂量组SOD、MDA和CAT水平均显著改善。

表2 Boc5对MCAO/R后血液生化指标的影响

3.3Boc5对MCAO/R损伤后脑梗死面积的影响 由于Boc5中剂量组小鼠在行为学实验中即表现出显著的行为缺陷，故选取Boc5中剂量组给药开展后续实验。见表3和图1。由表3和图1可知，MCAO/R损伤后小鼠脑区出现大面积梗死(白色)；与模型组比较，Boc5 中剂量组能显著减小小鼠脑梗死面积。

图1 Boc5对MCAO/R损伤后脑梗死面积的影响

表3 Boc5对MCAO/R损伤后脑梗死面积的影响

3.4Boc5对MCAO/R致血脑屏障损伤的影响 见表4和图2。由表4可知，模型组血脑屏障通透性明显增加，与模型组相比，Boc5中剂量组血脑屏障通透性显著降低。由图2可知，模型组缺血半暗区闭合蛋白、紧密连接蛋白-5表达显著降低，而Boc5中剂量组则显著增加闭合蛋白、紧密连接蛋白-5表达水平。实验结果表明，Boc5可显著减轻MCAO/R所致的血脑屏障损伤。

图2 Western Blot结果

表4 Boc5对MCAO/R致血脑屏障损伤的影响

3.5Boc5对MCAO/R损伤后星形胶质细胞增殖及活化的影响 见图3和表5。由图3和表5可知，MCAO/R损伤24 h后，模型组缺血半暗区内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数量显著增加，而Boc5中剂量组GFAP阳性细胞数量显著减少。表明Boc5能够改善MCAO/R损伤后星形胶质细胞增殖及活化。

图3 Boc5对MCAO/R损伤后星形胶质细胞增殖及活化的影响

表5 Boc5对MCAO/R损伤后GFAP阳性细胞数量的影响

3.6Boc5降低OGD/R损伤后星形胶质细胞炎性因子水平 CIRI后星形胶质细胞的增生和活化产生的炎性因子是导致血脑屏障破坏的重要原因。体外培养星形胶质细胞，ELISA法检测OGD/R损伤后炎性因子水平，评价Boc5对星形胶质细胞所致炎症反应的影响。ELISA实验结果表明，氧糖剥夺损伤(OGD) 6 h，复氧24 h后，IL-1β、TNF-α和IL-6水平显著增加，而Boc5可显著降低IL-1β、TNF-α和IL-6炎性因子水平，见表6。

表6 Boc5对星形胶质细胞OGD/R损伤后炎性因子水平的影响

4 讨论

缺血性脑卒中严重影响人类生命健康，寻找切实有效的防治靶点是科学家研究的热点[27-28]。既往研究表明，GLP-1R激动剂exendin-4、liraglutide和pro-GLP-1等能有效减轻脑缺血面积、改善行为缺陷、减少神经元细胞死亡和减轻炎性反应，表明GLP-1R激动剂能成为防治CIRI的有效药物[29]。目前，已有GLP-1R激动剂艾塞那肽、利拉鲁肽批准上市，然而这些药物均为多肽类药物，存在不能口服给药的缺点。近年来，相继发现了一些具有口服活性的小分子GLP-1R激动剂[30]，其中Boc5具有安全性高、半衰期长和能够透过血脑屏障的优点，具有较好的成药性，本研究所采用剂量为前期实验报道的安全剂量。本研究进一步发现，Boc5口服给药后能够显著减轻MCAO/R所致的损伤。以上研究表明，Boc5可能成为具有口服吸收活性的防治CIRI的有效药物。

星形胶质细胞产生的炎性因子是加重CIRI后血脑屏障损伤的重要诱因。本实验结果表明，Boc5能降低星形胶质细胞OGD/R释放的炎性因子水平。据此推测，Boc5的作用机制可能是通过激活星形胶质细胞GLP-1R，通过减少炎性因子释放减轻CIRI后血脑屏障损伤，最终改善CIRI，其确切机制还需进一步实验证实。