提高小儿健胃咀嚼片质量标准的研究

张笑笑，张 鑫，贺敬霞，张晓莉，党艳妮，陈衍斌*

(1.陕西国际商贸学院，咸阳 712046；2.陕西步长高新制药有限公司，西安 710075)

小儿健胃咀嚼片是由沙参、稻芽、白芍、玉竹、炒麦芽、山楂、麦冬、陈皮等11味药材经提取制成的中药复方制剂，具有健脾消食、清热养阴的功效，主治脾胃阴虚所致的食欲减退和消化不良[1]。方中荷叶、麦芽在处方中占比较大，本研究遵循以主药成分为控制要素的原则，并增加对制剂主药荷叶、麦芽的薄层色谱(TLC)鉴别。麦芽性平味甘，归脾、胃经，主要功效是行气消食、健胃开脾[2-3]，在小儿健胃咀嚼片中发挥重要作用。陈皮中主要含黄酮类化学成分，具有理气健脾、燥湿化痰的功效[4-5]。近年来研究发现，橙皮苷对胃肠有兴奋作用，能明显拮抗阿托品、肾上腺素引起的小肠胃排空和小肠推进抑制作用，对平滑肌也有明显的先兴奋后抑制作用，是健胃消食类药物的主要成分之一[6-7]。

小儿健胃咀嚼片药品标准于2010年获得国家食品药品监督管理局的审批，并已实施。标准中通过TLC鉴别对北沙参、白芍、荷叶进行鉴定，通过高效液相色谱法(HPLC)对陈皮中橙皮苷的含量进行控制，但其标准控制项较单一，难以对小儿健胃咀嚼片进行全面的质量控制。因此，本研究在现行质量标准的基础上[1]，参考相关文献，增加了荷叶药材(荷叶碱)和麦芽药材的TLC鉴别[8-9]，建立了一种快速、高效且能同时测定小儿健胃咀嚼片中橙皮苷和芸香柚皮苷含量的测定方法[10-12]，旨在为小儿健胃咀嚼片的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 ACQuity Class UPLC系统，包含二元高压泵在线脱气装置、自动进样器、柱温箱(美国Waters公司)；MS403TS102型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；ZF-2C型暗箱式自动紫外分析仪(上海安亭电子仪器厂)；KQ-800KDE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q Direct 8型纯水机[默克化工技术(上海)有限公司]；光电二级管阵列(PDA)检测器(美国Waters公司)。

1.2试药 荷叶对照药材(批号121322-201805)、荷叶碱对照品(批号111566-201907)、麦芽对照药材(批号121105-201808)和橙皮苷对照品(批号110721-201818，质量分数为96%)，均购自中国食品药品检定研究院；芸香柚皮苷对照品(批号MUST-19101010，质量分数为98%，成都曼斯特生物技术有限公司)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工有限公司)；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；氢氧化钾、碘化钾(天津科密欧化学试剂有限公司)；水为自制超纯去离子水；其他试剂均为分析纯。小儿健胃咀嚼片(批号分别为：20001、20002、20003，山东神州制药有限公司)。

2 方法与结果

2.1TLC鉴别

2.1.1荷叶 分别取3批小儿健胃咀嚼片，研成粉末，称取4 g，加水40 mL，超声处理30 min，滤过，滤液用浓氨调节pH值至10～12，加三氯甲烷振摇提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取荷叶对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。取荷叶碱对照品适量，加三氯甲烷溶液制成质量浓度为0.6 mg·mL-1的荷叶碱对照品溶液。取处方量的1/10，按照小儿健胃咀嚼片处方比例制备不含荷叶的阴性样品，再按照上述供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。按照TLC法进行实验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶0.5)为展开剂，展开7.5 cm，取出，晾干，喷以改良的碘化铋钾试液，日光灯下检视。结果表明，供试品在与荷叶对照药材和荷叶碱对照品相应的位置上显相同颜色的斑点，且阴性溶液无干扰。见图1A。

2.1.2麦芽 分别取3批小儿健胃咀嚼片，研成粉末，称取8 g，加无水乙醇50 mL，超声处理40 min，滤过，滤液加500 g·L-1的氢氧化钾1.5 mL，加热回流15 min，置于冰浴中冷却5 min，移至分液漏斗，加水20 mL 洗涤回流所用玻璃仪器，将水液合并置于分液漏斗中，用石油醚(30～60 ℃)振摇提取3 次，每次20 mL，合并石油醚液，挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取麦芽对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。取处方量的1/10，按照小儿健胃咀嚼片处方比例制备不含麦芽的阴性样品，再按照上述供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。按照TLC法进行实验，吸取上述溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯(10∶10∶2)为展开剂，展开8.0 cm，晾干，再以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯(10∶10∶1)为展开剂，展开，晾干，喷以体积分数为15%的硝酸乙醇溶液，显色，晾干，置于紫外光灯365 nm处检视。结果表明，供试品在与麦芽对照药材相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，且阴性溶液无干扰。见图1B。

图1 TLC图

2.2陈皮药材中橙皮苷和芸香柚皮苷的含量测定

2.2.1溶液的制备

2.2.1.1供试品溶液 分别取3批次小儿健胃咀嚼片，研成粉末，精密称取1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70%的甲醇10 mL，称定质量，超声提取30 min(53 kHz，500 W)，放冷，再称定质量，用体积分数为70%的甲醇补足减失的质量，滤液过0.22 μm滤膜，即得。

2.2.1.2混合对照品溶液 精密称取橙皮苷、芸香柚皮苷对照品粉末适量，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，制成2种成分质量浓度分别为203.46、87.00 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.1.3阴性样品溶液 取处方量的1/10，按照小儿健胃咀嚼片处方比例和制备工艺制备缺陈皮的阴性样品，再按照2.2.1.1项下方法制备阴性样品溶液。

2.2.2色谱条件 色谱柱为Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)柱。流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(洗脱程序为0～5 min，15%A～21%A；5～6 min，21%A～45%A；6～11 min，45%A～75%A；11～12 min，75%A～15%A)。流速为0.3 mL·min-1；柱温为35 ℃；进样量为2 μL；检测波长为283 nm。

2.3方法学考察

2.3.1专属性实验 精密吸取2.2.1项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液以及缺陈皮的阴性样品溶液各2 μL，进样分析。结果表明，在2.2.2项下色谱条件下，供试品溶液中橙皮苷和芸香柚皮苷与其他组分色谱峰均可达到基线分离(分离度大于1.5)，且阴性供试品溶液无干扰。见图2。

图2 UPLC图

2.3.2线性范围考察 按照2.2.1.2项下方法制备系列混合对照品溶液，其中橙皮苷的质量浓度分别为10.17、30.52、61.04、91.55、152.60 μg·mL-1，芸香柚皮苷的质量浓度分别为4.35、13.05、26.10、39.15、65.25 μg·mL-1。分别精密吸取上述系列混合对照品溶液注入超高效液相色谱(UPLC)仪，按照2.2.2项下色谱条件测定，以各成分峰面积为纵坐标(y)、各成分质量浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，制得橙皮苷和芸香柚皮苷的回归方程分别为y1=11 644x1+2 374.6(r1=0.999 9)和y2=8 981.7x2+33 139(r2=0.999 9)，线性范围分别为10.17～152.60、4.35～65.25 μg·mL-1。

2.3.3精密度实验 精密吸取2.2.1.2项下制备的混合对照品溶液2 μL，连续进样6次，按照2.2.2项下色谱条件进样测定，测得橙皮苷、芸香柚皮苷峰面积积分的RSD值分别为1.23%、0.89%，表明该仪器精密度良好。

2.3.4重复性实验 取同一批样品(批号20003)，按照2.2.1.1项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.2.2项下色谱条件进样测定，测得供试品溶液中橙皮苷和芸香柚皮苷的平均含量分别为31.52、8.90 μg·mL-1，其RSD值分别为1.65%、1.17%，表明该方法重复性良好。

2.3.5稳定性实验 取同一批样品(批号20003)，按照2.2.1.1项下方法制备供试品溶液，在制备后0、2、4、6、8、10、12，16，20、24 h分别进样，测得供试品中橙皮苷和芸香柚皮苷峰面积积分的RSD值分别为0.43%、0.94%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6回收率实验 精密称定同一批样品(批号20003)6份，分别精密加入2.2.1.2项下制备的混合对照品溶液适量，按照2.2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2.2项下色谱条件进样测定，计算各组分回收率。结果见表1。

表1 回收率实验结果 (n=6)

2.4含量测定 取3批小儿健胃咀嚼片，按照2.2.1.2项下方法制备供试品溶液，按照2.2.2项下色谱条件进样分析，计算3批样品中橙皮苷和芸香柚皮苷的含量，结果见表2。由表2可知，小儿健胃咀嚼片每1 g含陈皮以芸香柚皮苷和橙皮苷计，芸香柚皮苷不得少于0.08 mg，橙皮苷不得少于0.32 mg。

表2 小儿健胃咀嚼片的含量测定结果

3 讨论

小儿健胃咀嚼片现行质量标准的含量控制项仅限于橙皮苷的含量测定，不能全面控制中药复方制剂的质量。本研究首次采用UPLC法同时测定了小儿健胃咀嚼片中橙皮苷和芸香柚皮苷的含量，该方法检测速度快，仅需要12 min即可完成检测、资源消耗小(3.6 mL流动相即可)，测定结果准确、重复性好，可为提高小儿健胃咀嚼片质量标准的研究提供参考。

3.1TLC鉴别药材的选择 小儿健胃咀嚼片现行质量标准中对北沙参、荷叶和白芍进行TLC鉴别，在此基础上，前期分别进行了山楂、牡丹皮、麦冬、玉竹、荷叶、麦芽和山药的TLC 鉴别预实验研究。结果发现，山楂、麦冬、玉竹和山药的阴性样品溶液均有较大干扰，因此不能通过调整供试品制备方法、展开剂和显色剂等予以排除；并且研究发现，麦冬和玉竹的阴性样品溶液互相干扰，经查阅文献可知，玉竹药材和麦冬药材均属于百合科，主要化学成分类型极为相似，均属甾体皂苷类[13-15]；在荷叶TLC鉴别中，增加荷叶碱对照品作为对照(而原标准仅采用荷叶对照药材作为对照)，可更加全面地控制荷叶药材的质量。实验结果显示，麦芽和荷叶斑点显色清晰、分离效果好，阴性样品溶液无干扰，故增加麦芽和荷叶TLC鉴别用于小儿健胃咀嚼片的质量控制。

3.2提取溶剂的选择 分别采用纯水、体积分数为50%的甲醇、体积分数为70%的甲醇作为提取溶剂，研究不同提取溶剂对样品中各待测组分溶出的影响，结果表明，以体积分数为70%的甲醇作为提取溶剂时，2种待测成分能同时出峰，且含量较高。

3.3提取方法的选择 分别考察了2种提取方法，即分别用体积分数为70%的甲醇超声提取30 min与加热回流提取1 h，测定待测组分峰面积。结果表明，超声提取较加热回流提取待测组分含量低，但超声提取法操作简单，节约时间，综合考虑最终选用超声提取法。

3.4液料比及提取时间的选择 分别考察了3、6、10、15、20倍提取液料比，结果表明，液料比为10、15倍时，样品中待测成分含量基本相同，因此，选定提取液料比为10倍。进一步实验确定提取时间(30、45、60 min)对样品中各待测成分溶出的影响，结果表明，各成分在提取30、45、60 min时结果基本相同，随着提取时间的延长，各成分含量变化不大，样品在提取30 min后各组分已基本全部被提取[16]。因此，最终选择10倍量体积分数为70%的甲醇超声提取30 min为小儿健胃咀嚼片的最佳提取方法。

3.5检测波长的选择 将小儿健胃咀嚼片样品溶液用PDA检测器在210～400 nm范围内做全波长扫描，得到橙皮苷、芸香柚皮苷在283 nm波长处有最大吸收[17]。在此基础上，综合考虑检测时各色谱峰的响应值要求，最终选择283 nm作为检测波长。

中药复方药味多，成分复杂[18]，难以找到有效的方法测定其有效成分，导致中药的发展始终滞后。近年来，众多研究者纷纷开展中药有效成分分析方法的研究，现已成为中药研究领域的热点[19-21]。本研究采用UPLC法对中药复方小儿健胃咀嚼片建立2种有效成分的含量测定，也确定了含量限度。但由于本次研究样品量较少，后期还需进一步对多个批次样品进行含量测定研究，从而保证含量限度的合理性。

综上所述，本研究成功建立了小儿健胃咀嚼片中麦芽、荷叶药材的定性鉴别方法和陈皮中芸香柚皮苷、橙皮苷的含量测定方法，均可用于小儿健胃咀嚼片的质量控制。