基于网络药理学探讨黄芪治疗慢传输型便秘作用机制

杨金玉，王凤飞，陆文洪，李帅军*

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005)

慢传输型便秘(STC)是最常见的慢性便秘之一，其病因及发病机制尚不明确，可能与肠神经系统、Cajal间质细胞、激素、神经递质、肠道菌群、精神心理、肠道平滑肌等因素相关[1]，多以结肠传输时间长，肠道蠕动减慢为特征。国外流行病学调查显示[2-4]，慢性便秘的发病率呈逐年上升趋势，且发病人群广，已严重影响人们的生活质量。

中药黄芪始载于《神农本草经》，具有补气升阳、利水消肿、固表止汗、托疮生肌等功效[5-6]。现代药理研究表明，黄芪含有黄芪皂苷、黄芪多糖、多种氨基酸等成分，在调节内分泌、抗衰老、抗肿瘤、抑菌及抑制病毒等方面具有重要作用[7]。其中所含的多糖氨基酸成分，通过增强肠蠕动及平滑肌张力，在改善便秘中发挥了重要作用[8]。临床上常使用黄芪治疗气虚型便秘。邱月平[9]通过对比分析黄芪汤治疗组与乳果糖对照组的临床疗效发现，治疗组的总有效率达92%，说明黄芪汤可有效缓解便秘患者临床症状。气血亏虚是便秘的基础状态，调态以“补气养血”为法，黄芪、当归为首选中药。金益等[10]通过文献研究发现，当归-黄芪是最常出现的配伍药对之一，二者配伍可共同发挥补血活血、养血润肠的作用。

中药具有多成分、多作用靶点及多作用途径的特点[11]。黄芪具有治疗慢传输型便秘的作用，但其成分、靶点与作用机制等尚不明确。因此，本研究以黄芪为研究对象，运用网络药理学方法筛选黄芪治疗STC的有效成分及潜在靶点，并进行生物信息学分析，得到黄芪分子作用机制，为进一步理论研究及临床应用提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 软件与数据库

利用 Cytoscape 3.7.2软件构建网络可视化图并进行数据分析，使用的主要数据库为TCMSP、GeneCards、OMIM、UniProt、Venn、STRING、David。

1.2 黄芪活性成分的筛选及其靶点的获取

在TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)数据库中查询黄芪的化学成分，口服生物利用度 (OB)及药物相似度 (DL)为常用的活性成分筛选指标[12-13]，设置OB≥30%、DL≥0.18 得到相关活性成分，点击“Related Targets”查找所需活性成分相关的蛋白靶点，并使用UniProt数据库[14]查询靶点蛋白对应的基因，对查询的基因进行归纳整理。

1.3 STC疾病相关靶基因的获取

以“slow transit constipation”为关键词在GeneCards及OMIM数据库检索相关疾病基因，将其进行整合，删除重复值，并归纳整理最终获得的靶基因。

1.4 黄芪活性成分与STC靶点的交集

将黄芪有效成分的相关靶点与STC的靶点导入Venn平台，得到黄芪活性成分与STC的交集靶点，并绘制Venn图。

1.5 蛋白相互作用 (PPI)网络构建

将“1.4”中得到的交集靶点导入STRING数据库，选择物种为“Homo sapiens”(人源)，设置“minimum required interaction score”为“Medium confidence=0.4”，其余参数为默认值，得到蛋白互作PPI网络，下载tsv文件，通过Cytoscape 3.7.2软件进行拓扑分析并筛选关键靶点。

1.6 GO富集功能分析与KEGG通路富集分析

为进一步研究黄芪作用机制，将交集后所得的靶点导入David数据库中进行GO富集功能分析，包括生物过程(BP)、细胞组分(CC)及分子功能(MF)，并进行KEGG通路富集分析，得到黄芪治疗STC的主要作用通路，进行可视化处理，探讨黄芪治疗STC可能的作用机制。

2 结果

2.1 黄芪活性成分筛选

在TCMSP数据库中以“黄芪”为检索词进行查询，共得到87个活性成分，设置OB≥30%、DL≥0.18，初步筛选出20个活性成分，见表1。

表1 黄芪活性成分基本信息

2.2 黄芪活性成分靶基因的获取及活性成分-基因靶点网络的构建

将4个未检索到靶蛋白的活性成分剔除后得到16个有效活性成分，将检索到的靶蛋白进行归纳整理，使用 Uniprot 数据库将检索到的所有靶点蛋白校正为官方名称 (Officical Symbol)，删除重复项后得到 172个作用靶点。将16个有效成分，172个相关靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件构建黄芪“活性成分-基因靶点”网络图(见图1)。16个菱形表示黄芪的活性成分，172个三角形表示黄芪对应的作用靶点，365条边代表靶点及化学成分之间的相互作用，体现了黄芪多成分、多靶点的特点。经计算，槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇(7-O-methylisomucronulatol)、刺芒柄花素(formononetin)、异鼠李素(isorhamnetin)的Degree值较高，见表2。

表2 关键活性成分

2.3 STC疾病相关靶基因的获取

在Gene Cards、OMIM数据库中检索关键词“slow transit constipation”，获取STC的潜在靶点，交集映射，去除重复值后，最终整合STC疾病靶点1 824个。

2.4 黄芪活性成分靶点与STC靶点的交集

通过绘制韦恩图进行交集分析，得到药物靶点中与STC相关的靶点共113个，包括MMP2、SLC6A2、HSPB1、PLAU、NOS2等，表明黄芪可多靶点治疗STC，见图2。

图2 黄芪靶点与STC相关靶点韦恩图

2.5 蛋白相互作用 (PPI)网络构建

PPI网络中有112个节点(其中有1个靶点未与其他靶点发生相互作用)，2 069条连线，见图3。对排序均在前20的度值及介数的靶点进行交集，共筛选出17个度值与介数的靶点，提示这些靶点在PPI网络中起关键作用，可能是黄芪治疗STC的关键靶点，见表3。

图3 靶蛋白PPI网络图

表3 关键靶点拓扑参数

2.6 GO富集功能分析与KEGG 通路富集分析

利用DAVID数据库进行GO富集功能分析，共获得287条GO条目(P<0.01)，其中生物过程(BP)条目218条，分子功能(CC)条目22条，细胞成分(MF)条目47条。用R软件绘制BP，CC及MF富集前10位的条形图见图4、图5、图6。其中BP涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正调控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、对药物的反应(Response to drug)、凋亡过程的负调控(Negative regulation of apoptotic process)与转录的正向调节，DNA模板(Positive regulation of transcription，DNA-templated)、缺乏配体的外源性凋亡信号通路(Extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand)等过程。CC涉及细胞外液(Extracellular space)、膜筏(Membrane raft)、胞外片段(Extracellular region)、细胞质(Cytosol)、细胞质核周区(Perinuclear region of cytoplasm)等部分。MF涉及酶结合(Enzyme binding)、蛋白结合(Protein binding)、相同蛋白质结合(Identical protein binding)、转录因子结合(Transcription factor binding)与蛋白激酶结合(Protein kinase binding)、蛋白质异源二聚体活性(Protein heterodimerization activity)等过程。KEGG分析共获得117条信号通路，有84条通路的P<0.01，按基因富集数进行排序，绘制前15条通路的气泡图见图7。其靶点在乙型肝炎、甲型流感、HTLV-I感染、恰加斯病(美国锥虫病)等疾病与癌症信号通路、PI3K/Akt信号通路、TNF信号通路、MAPK 信号通路等上富集较多。

图4 GO-BP分析结果条形图

图5 GO-CC分析结果条形图

图6 GO-MF分析结果条形图

图7 KEGG富集分析的前15条通路图

3 讨论

慢传输型便秘(STC)因其病理生理机制复杂，目前其治疗尚未取得满意的疗效。中医根据其发病的病因病机进行多层次、多角度的辨证施治，治疗效果较好[15-16]。中医认为STC以本虚标实为主，多以气虚型为主要证候，临床治疗以虚者补之为主要治则。相关文献[17]表明，以黄芪为主的方剂可有效改善气虚型功能性便秘，但其有效成分及作用机制尚不明确。本研究使用TCMSP数据库筛选出16种有效活性成分，包括丁子香萜、华良姜素、常春藤皂苷元、异鼠李素、3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素等，其中槲皮素是关联靶点最多且Dgree值最高的活性成分。槲皮素是天然存在的黄酮类物质，槲皮素通过增加拟杆菌及减少变形杆菌，调节肠道菌群失衡状态，从而恢复宿主微生物的平衡[18]。陈樱萌等[19]通过研究小鼠体内外槲皮素对肠道菌群的调节作用，结果表明，槲皮素可调节肠道菌群失调状态，可一定程度缓解消化系统临床症状。张晋蔚[20]研究表明，槲皮素可降低结肠黏膜水通道蛋白表达，减少对肠道内容物水分吸收，从而起到缓解慢性传输性便秘症状的作用。

PPI网络分析结果发现，AKT1、TP53、IL6、VEGFA、CASP3、MAPK8等17个靶标可能是黄芪治疗STC的关键靶点。AKT是一种蛋白激酶，它是P13K信号传导通路下游一个重要的激酶，分为AKT1、AKT2、AKT3三个亚型。AKT参与P13K/AKT/mTOR细胞信号传导途径，通过促进ICC增殖、抑制ICC凋亡从而发挥治疗STC的作用[21]。康倩锋[22]研究表明，可通过降低便秘患者炎症因子水平，包括 IL-6 等，改善便秘状态。MAPK可以调节细胞的增殖、分化及凋亡[23]。MAPK通过调节水通道蛋白(AQPs)在细胞中的表达从而起到促进调节水分运输的作用[24]。TP53、VEGFA、CASP3共同调节细胞增殖和凋亡，富集的信号通路多样，包括癌症信号通路、PI3K/AKT 信号通路、MAPK信号通路。

GO分析结果表明，黄芪可能在RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正调控、对药物的反应、凋亡过程的负调控、转录的正向调节、DNA模板、缺乏配体的外源性凋亡信号通路等过程中发挥治疗STC的功效。KEGG结果提示，黄芪治疗STC的主要通路为癌症信号通路、PI3K/Akt信号通路、TNF信号通路、MAPK 信号通路。PI3K激活后产生PIP3与AKT结合，Akt磷酸化后可调节细胞生长因子，促进细胞的生长、增殖，抑制细胞凋亡；P-Akt表达明显降低可使结肠组织NO含量增多，可抑制平滑肌收缩，减少胃肠道蠕动[25]。研究表明，水通道蛋白 (AQPs)通过调整结肠内生物膜的透水性从而维持结肠内水代谢平衡，而 MAPK信号通路中 ERK、JNK、p38 MAPK的激活与水通道蛋白的表达有一定的相关性，与STC的发生紧密相关[26]。尽管癌症信号通路及TNF信号通路在STC的发生、发展中发挥着重要作用，但目前对其研究较少，有关作用机制尚不清楚，今后可从相关通路着手进行研究。

本研究通过网络药理学探讨黄芪治疗STC的分子机制，结果显示，黄芪中槲皮素等16个活性成分通过AKT1、TP53、IL6等113个作用靶点调控PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路等84条信号通路发挥治疗STC的作用，体现了黄芪多成分、多靶点、多通路协调发挥促进细胞增殖、诱导凋亡、减轻炎症反应等药理作用治疗STC的特点。而黄芪是否通过这些核心靶点与通路发挥治疗STC的功效，还需进一步实验研究证实。