基于数据挖掘和网络药理学探讨桑椹治疗女性不孕症的用药规律和作用机制

曹礼慧，冯森玲，袁中文，刘丽娟

(广东省产科重大疾病重点实验室，广州医科大学附属第三医院 药学部，广东 广州 510150)

世界卫生组织定义不孕症为规律性生活、未采取任何避孕措施至少1年仍未受孕。不孕的原因可能在女方、男方或男女双方。由于社会不断发展，现代女性生活和工作压力不断增大，女性不孕症的发病率逐年升高，作为一种特殊的生殖健康缺陷，备受关注。现代医学认为女性不孕症主要有排卵障碍、输卵管阻塞或不畅、子宫问题、宫颈问题等原因，中医学则认为肾气亏虚，冲任气血失调可能是导致不孕症发生的原因，故按照不同的病因病机，中医将不孕症分为肾气虚型、肾阳虚型、肾阴虚型、肝郁型、痰郁型、血郁型等证型[1]。治疗不孕症的药物和方法层出不穷，其中《黄帝内经》阐述不孕的机理为“肾气衰，天癸竭，地道不通，故形坏而无子”，因此中医认为女子受孕需具备三个条件：肾精充足，肝血充盛；胞络通畅；胞宫寒温适度。

桑椹记载于《中国药典》[2](2020年版)，为桑科植物桑的干燥果穗，具有滋阴补血、生津润燥的功效，用于肝肾阴虚、眩晕耳鸣、心悸失眠、须发早白、津伤口渴、内热消渴、肠燥便秘。为常用的补肝肾中药，既可入药，又可食用，具有良好的滋补功效[3]。研究表明[4]，桑椹含有丰富的营养物质，其中蛋白质对于调节生理功能、维持新陈代谢发挥重要作用，一定的糖类是促进机体生长发育不可替代的物质，适量的酸类对于调节酸碱平衡必不可少。同时，桑椹还含有丰富的矿物质，其中钾含量最高，在维持神经和肌肉活动及肾上腺方面发挥重要作用，而锌可以调节血糖代谢与维持性功能。桑椹营养丰富，现代药理学研究发现[5]，桑椹具有提高免疫力、改善睡眠、延缓衰老、抗氧化、抗感染、降血糖、降血脂等作用[6，7]。

1 资料与方法

1.1 处方来源及筛选

检索我院2019年7月-2019年12月含桑椹的女性不孕症中药处方。检索关键词为“桑椹”“不孕症”。纳入标准：①处方诊断包含女性不孕症；②处方用药信息完整。排除标准：①重复处方，只记录一次；②外用处方；③录入错误等不规范处方。

1.2 数据处理

参照对中药名称、药物类别、性味归经等，按照《中国药典》(2020年版)、地方炮制规范和执行标准进行规范收录内容进行规范化处理。

1.3 统计学分析

运用Excel 2013对纳入数据建立数据库，对药物类别、药物味数和性味归经进行描述性分析。运用SPSS Statistics 21.0进行聚类分析，SPSS Modeler 18.0进行关联规则分析，网络药理学方法收集中药的活性成分、靶点以及疾病靶点，将中药与疾病的交集靶点导入Cytoscape软件(https：//cytoscape.org/)绘制“疾病-中药-活性成分-靶点”网络图，运用Metascape数据库(http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)进行GO和KEGG富集分析。

2 结果

2.1 纳入处方情况

纳入处方354张，涉及175味中药，其中按照药物类别可分为15类，其中补虚药(42味)、清热药(25味)、利水渗湿药(15味)、活血化瘀药(15味)、理气药(14味)、收涩药(11味)、解表药(11味)等。频数最多的有补虚药(2 175次，56.13%)、祛风湿药(314次，8.10%)、活血化瘀药(266次，6.86%)、收涩药(249次，6.43%)等。具体见表1、图1。

2.2 高频中药性味归经及频数统计

对175味中药进行频数分析，频数共2 193次，其中≥30次的高频中药有33味，如桑椹、女贞子、菟丝子、金樱子等。药性频数共2 913次，以温(963次，33.06%)、平(929次，31.89%)为主；药味频数共计5 411次，药味以甘(2 530次，46.76%)、苦(1 147次，21.20%)和辛(780次，14.42%)为主；含10种归经，累计频数7 009次，其中以肾经(2 184次，31.16%)、肝经(2 155 次，30.75%)为主。具体见表2、图2。

图2 桑椹治疗女性不孕症处方高频药物性味归经统计

2.3 高频中药聚类分析

运用SPSS Statistics 21.0软件对高频中药采用组间连接的方法进行聚类分析，如图3。可分为7类，类1：天山雪莲、红芪、桑寄生、艾叶、狗脊、黑豆衣、续断、大枣、红景天、香附、淫羊藿、杜仲；类2：金樱子、茺蔚子、女贞子；类3：菟丝子、沙苑子、枸杞子、秦艽、太子参、鹿角胶、白及、山茱萸、茯神；类4：熟地黄、当归、山药、葛根、天冬；类5：白术、茯苓；类6：桑椹；类7：益母草。

图3 桑椹治疗女性不孕症处方高频药物聚类分析谱系

2.4 高频中药关联规则分析

对高频中药采用SPSS Modeler 18.0软件进行关联规则分析，运用Apriori算法，设置最小支持度30%，最小置信度80%，最大前项数为2时，输出关联规则见表3，网络化展示如图4。其中二项关联主要有桑椹-女贞子；三项关联主要有桑椹-菟丝子-女贞子等。

表3 桑椹治疗女性不孕症处方的关联规则

图4 高频药物关联网络化展示

2.5 核心药物治疗女性不孕症的网络药理学

基于数据挖掘，桑椹-菟丝子-女贞子可能为治疗女性不孕症的核心药物。运用TCMSP数据库检索核心药物的活性成分和作用靶点，设置口服生物利用度(OB)≥30%以及类药性(DL)≥0.18，共筛选出30个化合物、98个作用靶点。通过GeneCards 数据库获得女性不孕症3983个靶点。运用Venny 2.1得到核心药物与女性不孕症的交集靶点66个。将交集靶点输入STRING 11.0在线数据库进行蛋白相互作用分析，物种选择“Homo sapiens”，隐藏散在靶点，其他参数保持默认设置，将蛋白相互作用的数据导入Cytoscape软件中，利用Cytoscape的CytoHubba中Maximal Clique Centrality(MCC)拓扑分析方法确定关键靶点有JUN、TNF、IL-6、IL-1β、IL-2、IFN-γ、TP53、CCL2、MAPK14、VEGFA。运用Cytoscape 软件绘制“疾病-中药-活性成分-靶点”，如图5。使用Metascape数据库对66个交集靶点进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，GO分析得到1 183条生物过程(Biological process，BP)，主要涉及活性氧代谢过程、细胞对氧化应激的反应、氧化应激反应等生物过程；KEGG通路富集得到243条信号通路，主要涉及癌症通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、糖尿病并发症的AGE-RAGE的信号通路等通路。两者富集的气泡图(前20条)如图6、图7。

图5 “疾病-中药-活性成分-靶点”网络

图6 GO富集分析的生物过程条目气泡图

图7 KEGG通路富集气泡图

3 讨论

3.1 基于描述性分析探讨桑椹治疗女性不孕症的用药特点

从药物类别及高频中药来看，多用补虚药，其次是清热药、利水渗湿药、活血化瘀药等。而频数≥30次的中药有33味，超过100次的分别有桑椹、女贞子、菟丝子、金樱子、沙苑子、茺蔚子、山药、桑寄生。补虚药主治气虚证、阳虚证、血虚证和阴虚证，临床多为几种虚证并存，需将两类及两类以上补虚药配伍使用，其中补气药多补脾气、肺气和心气等，如山药，具有补脾养胃，生津益肺，补肾涩精的功效，临床用于脾虚证、肺虚证和肾虚证，能够补后天有助于充养先天，补肾名方多含有山药；补阳药主入肾经，能补一身之元阳，主要适用肾阳不足之宫冷不孕等，如菟丝子和沙苑子均具有补肾固精之功效，菟丝子为常用补肾中药，常用于肾虚、腰膝酸软等病症，其药理作用有增强免疫力、降血糖、抗氧化[8]等；补血药主入心肝血分，肝血亏虚，精血不足，肾中之精不能得肝血以充盈，从而导致不孕症[9]；补阴药能滋养肝肾之阴，如桑椹、女贞子等，桑椹和女贞子都具有延缓衰老、抑菌等作用[10、11]。而桑寄生作为祛风湿药具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎元之功效；金樱子作为收涩药用于治疗遗精滑精，遗尿尿频，崩漏带下，久泻久痢；茺蔚子作为活血化瘀药能够活血调经，归心包、肝经。因此，桑椹配伍补虚药山药、菟丝子、沙苑子、女贞子以及祛风湿药桑寄生、收涩药金樱子和活血化瘀药茺蔚子等均表明有良好的治疗女性不孕症的作用。

从中药性味归经分析，桑椹治疗女性不孕症药性以温性与平性较高，体现了女性不孕症的致病因素以寒邪为主，如《本草纲目》中提到“久则子宫冷，自不孕矣”。药味则以甘、苦和辛为主，研究发现，甘味药[12]能通过补益作用治疗虚损病症，以入肝、肺、肾、胃经为主；苦味药[13-14]具有理气宽中、活血化瘀、祛风除湿、清热解毒等功效，多入肝、肺、胃经；《黄帝内经》“肝欲散，急食辛以散之，以辛补之”，《素问·藏气法时论》“肾苦燥，急食辛以润之，开腠理，致津液，通气也”，两者体现了辛味药[15]能散、能润的特点。归经方面，肝疏泄失常，气机不畅，冲任二脉失和，女性可出现月经紊乱，甚至痛经、闭经和不孕。肝血不足，则月经量少，甚则闭经等；肾的主要功能是主生长发育和生殖，若肾中精气亏损，女性则表现为不孕等病症，肝郁影响肾气而至肾虚，肾虚产生肝郁，治疗女性不孕症应把肝肾同治作为基本原则[16]。本研究中桑椹治疗女性不孕症处方中各中药主入肝经和肾经，对肝、肾有特殊的亲和作用。

3.2 基于聚类分析探讨桑椹治疗女性不孕症的用药特点

高频中药系统聚类采用组间联接方法得到7类。多为经典方剂如四物汤、八珍汤、六味地黄汤等重要组成成分。其中类1主要为补虚药和祛风湿药、止血药等；类2为补虚药、收涩药、活血化瘀药；类3为补虚药、止血药、收涩药、祛风湿药、利水渗湿药；类4为补虚药；类5为补虚药、利水渗湿药；类6为补虚药；类7为活血化瘀药。可见，聚类分析中各类中药物主要为补虚药，与药物类别结果一致。

3.3 基于关联规则的网络药理学机制分析

从关联规则和网络药理学药对分析，支持度高的核心药对二项关联有桑椹-女贞子、桑椹-菟丝子、桑椹-金樱子，三项关联支持度较高的是桑椹-菟丝子-女贞子。由此可以看出，桑椹治疗女性不孕症核心药物可能是桑椹-菟丝子-女贞子。将核心药物进行网络药理学分析发现，其治疗女性不孕症的活性成分可能为槲皮素、山柰酚、芝麻素、异鼠李素、β-谷甾醇、桑黄素、木犀草素、β-胡萝卜素、圣草素等17种活性成分。有文献报道，槲皮素能缓解多柔比星诱导的雌性不孕[17]，能够改善卵巢早衰[18]，对孕鼠子宫内膜损伤具有保护作用[19]；木犀草素能有效抑制卵巢过度刺激综合征大鼠卵巢组织的炎症反应及血管通透性[20]；克罗米芬联合β-胡萝卜素对精索静脉曲张伴不育高位结扎术后的精子质量和性激素水平改善明显，提高了手术效果，增加了受孕率[21]。JUN、TNF、IL-6、IL-1β、IL-2、IFN-γ、TP53、CCL2、MAPK14、VEGFA为核心药物治疗女性不孕症的关键靶点，IL-6可能通过胰岛素抵抗及慢性炎症协同作用在多囊卵巢疾病中发挥作用[22]，TNF、IL-1β、IFN-γ为促炎因子，影响了全身炎症反应，从而影响卵巢功能[23]。GO分析证实了核心药物对活性氧代谢过程、细胞对氧化应激的反应、氧化应激反应、有毒物质的反应等生物过程有一定的影响，KEGG富集分析证实了核心药物对癌症通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、糖尿病并发症的AGE-RAGE的信号通路等有调控作用。

通过数据挖掘和网络药理学研究发现，桑椹治疗女性不孕症处方，多配伍补虚药，如女贞子、菟丝子、沙苑子、山药等，药性以温、平为主，药味以甘、苦为主，多归肝经和肾经。核心药物可能是桑椹-菟丝子-女贞子，其治疗女性不孕症具有多成分、多靶点、多通路的作用机制。