马钱苷对小鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

应夏丽，王晓玲，陈妍月，严洁萍，李 莉

(1淳安县第一人民医院·浙江 杭州 311700；2浙江中医药大学·浙江 杭州 311402；3浙江省人民医院·浙江 杭州 310014)

脑卒中已成为威胁人类健康的第三大“杀手”，具有高发病率、高致残率和高死亡率等特点[1-2]。脑卒中分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中，其中缺血性脑卒中约占80%[3]。治疗缺血性卒中关键在于及时恢复缺血区域的血液供应[4]，但血流的恢复可能会进一步加重缺血导致的神经元损伤，即脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)[5]。

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉，为临床常用中药，具有补益肝肾、收涩固脱等功效[6]，是浙江产道地药材。山茱萸环烯醚萜苷类是其主要活性成分，研究发现其能减少大鼠局灶性脑缺血脑梗死体积，对缺血再灌注造成的全脑损伤有保护作用，并可延长低压缺氧小鼠存活时间，作用机制主要表现为抑制神经元细胞凋亡和抗血小板聚集[7-10]。马钱苷(C17H26O10)作为山茱萸环烯醚萜苷中的主体成分，目前尚未见其对CIRI的相关研究，故本课题组探讨马钱苷对CIRI小鼠的保护作用机制，为马钱苷临床治疗脑缺血和开发相关药物提供临床前研究依据。

1 材料

1.1 动物 健康ICR小鼠，SPF级，雄性，23～27 g，饲养于浙江中医药大学实验动物研究中心，动物合格证号：SYXK(浙)2013-184。

1.2 药物 马钱苷：上海源叶生物科技有限公司，批号：18524-94-2；HPLC大于或等于98%。依达拉奉注射液：吉林博大制药有限公司，批号：02-1800772。

1.3 主要试剂及仪器 Caspase-3抗体：博士德生物工程有限公司，批号：ZP4127BP27；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒：瑞士Roche公司，批号：39006700。自动染色机：Autostainer XL，Leica公司，德国；RM2245石蜡切片机：Leica公司，德国；2.0 RS数字切片扫描设备：滨松公司，日本；VS120-S60W病理切片(荧光)扫描分析仪：Olympus公司，日本；EMUC7超薄切片机：美国Leica公司；H-7650 型透射电镜：日本Hitachi公司；荧光显微镜：Carl Zeiss公司，中国。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 将ICR小鼠随机分为假手术组、模型组、依达拉奉(5 mg/kg)组及马钱苷(5、10、15 mg/kg)组，每组8只。实验前小鼠禁食不禁水12 h，参照Longa等[11]方法造模进行改进。仰卧位固定，沿颈部正中切开约1 cm，分离颈总动脉，并于其结扎部位上方约1 mm处剪口，插入栓线(1620-A4，1622-A4，1623-A4，北京西科农技有限公司)使小鼠左侧大脑中动脉栓塞(MCAO)，缺血1 h后，缓慢抽出拴线，再灌注24 h，建立小鼠CIRI模型。其中假手术组仅分离颈总动脉及颈外动脉，不栓塞大脑中动脉。MCAO后立即腹腔注射给药，假手术组和模型组腹腔注射等体积生理盐水。

2.2 观察指标及测定

2.2.1 神经功能缺损评分 参照Bederson[12]确立的5级评分法对小鼠的神经功能缺损进行评分，1～3级定为造模成功，0、4级弃去。

2.2.2 脑梗死体积测定 再灌注24 h后，处死小鼠，取脑，-20 ℃冷冻10 min，取出，均匀切成5 片，2%TTC溶液37 ℃避光温孵10 min，4%多聚甲醛固定，取出，拍照。用Image Pro Plus统计脑梗死体积。脑梗死体积(%)=(正常侧大脑半球体积-梗死侧非梗死区的体积)/2倍正常侧大脑半球体积×100%

2.2.3 脑含水量、脑指数测定 吸干脑组织表面液体，精密(精确度1/10 000)称取湿重，100 ℃烘干至恒重，称取干重。脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/ 湿重×100%；脑指数=脑湿重×100/体重。

2.2.4 病理学观察 小鼠CIRI后，麻醉小鼠，取4%多聚甲醛心脏灌注，取脑组织，4%多聚甲醛固定，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片。将切片依次置于纯二甲苯、乙醇中脱蜡；按常规HE染色法染色；不同浓度乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察、拍照。取缺血区大脑皮层组织块1 mm3，放入2.5%戊二醛溶液4 ℃固定，取出，超薄切片，醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液染色1 h，柠檬酸铅溶液染色15 min，在透射电镜下观察缺血区线粒体与内质网超微结构。

2.2.5 TUNEL检测细胞凋亡 将切片依次放入由100%乙醇至蒸馏水中梯度脱蜡；滴加20 mg/L不含DNase的蛋白酶K，37 ℃孵育20 min，PBS洗涤3次；滴加50 μLTUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤3次；加抗荧光淬灭液封片，荧光显微镜下观察，拍照。绿色荧光显色为凋亡细胞，每张切片在缺血皮层区随机取5处，计算各组缺血皮层区单位面积内细胞凋亡数。

2.2.6 免疫组织化学染色法检测缺血区caspase-3蛋白表达 照SABC试剂盒方法进行caspase-3免疫组织化学染色，制片，显微镜观察。胞浆着色呈棕黄色为阳性细胞，每张切片在缺血皮层区随机取5处，采用Image J软件统计分析所捕获的图像中染成黄色或棕黄色物质的阳性面积和统计场总面积，以阳性面积/统计场总面积比值作为caspase-3蛋白阳性表达百分率。

3 结果

3.1 马钱苷对CIRI小鼠神经功能评分、脑梗死体积、脑含水量及脑指数的影响 结果见表1。

表1 各组小鼠神经功能评分、脑梗死体积、脑含水量及脑指数的比较

3.2 马钱苷对CIRI小鼠大脑病理组织学的影响 假手术组小鼠大脑神经细胞形态正常，结构完整，核膜、核仁边界清楚，CA1区锥体神经元排列整齐紧密，边界清晰未见异常。模型组小鼠大脑皮层结构疏松呈空隙状，神经元胞体变形、胞核固缩、溶解或消失，CA1区神经元排列疏松无规律。与模型组相比，马钱苷各剂量组及依达拉奉组CIRI小鼠缺血区神经元细胞病理结构均得到不同程度改善，其中马钱苷15 mg/kg组和依达拉奉组CIRI小鼠神经细胞结构趋于完整，病理情况得到明显改善。结果见图1、图2。

图1 各组小鼠大脑皮层病理形态学变化(HE, ×400)

图2 各组小鼠大脑海马CA1区病理形态学变化(HE, ×400)

3.3 马钱苷对CIRI小鼠缺血区皮层神经细胞超微结构的影响 假手术组小鼠脑缺血区神经元细胞线粒体结构完整，呈圆形和卵圆形，外膜光滑，内嵴清晰，内腔无扩张，基质密度均匀；粗面内质网形态完整，呈扁平囊状，排列整齐。模型组小鼠神经细胞线粒体扩张，外膜破坏、溶解，嵴排列紊乱或消失，胞质内水肿明显，粗面内质网核糖体脱离。与模型组相比，马钱苷各剂量组及依达拉奉组小鼠神经元细胞线粒体嵴排列紊乱程度、空泡现象及线粒体、内质网肿大程度得到不同程度的改善，其中马钱苷15 mg/kg组和依达拉奉组小鼠神经元细胞线粒体结构趋于完整，粗面内质网核糖体脱离情况得到明显改善。见图3。

注：→，表示线粒体；△，表示内质网图3 各组小鼠缺血区神经元细胞的超微结构变化(×30 000)

3.4 马钱苷对CIRI小鼠大脑皮层神经细胞凋亡的影响 假手术组小鼠大脑皮层神经细胞偶有凋亡。与假手术组相比，模型组小鼠大脑皮层可见大量细胞凋亡，细胞凋亡数量极显著增加(P<0.01)。与模型组相比，马钱苷各剂量组和依达拉奉组神经元细胞凋亡数量均不同程度减少，其中马钱苷10、15 mg/kg组和依达拉奉组神经细胞凋亡数量极显著性减少(P<0.01)。结果见图4，图5。

注：与假手术组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01图4 各组小鼠脑缺血区细胞凋亡计数比较(动物数：8 只)

图5 各组小鼠脑缺血区细胞凋亡TUNEL法测结果(×400)

3.5 马钱苷对CIRI小鼠脑缺血区皮层 caspase-3 蛋白表达水平的影响 缺血区Caspase-3蛋白阳性细胞呈棕黄色，为胞质着色。与假手术组相比，模型组Caspase-3蛋白表达极显著增加(P<0.01)。与模型组相比，马钱苷10 mg/kg组Caspase-3蛋白表达明显减少(P<0.05)；马钱苷15 mg/kg组和依达拉奉组能极显著减少Caspase-3蛋白表达(P<0.01)。结果见图6、图7。

注：与假手术组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01图6 各组小鼠缺血区caspase-3阳性细胞面积比较(动物数：8 只)

图7 各组小鼠脑缺血区皮层caspase-3蛋白表达免疫组化测定(×400)

4 讨论

CIRI常表现为大范围的脑水肿、梗死或者出血，引起神经元损伤，使患者留下严重后遗症。再灌注损伤也是发生急性脑缺血早期恢复血供后不可避免且不可逆的病理损伤[13]。Jeonga E.J等[14]研究发现，山茱萸环烯醚萜苷对谷氨酸盐诱导损伤的海马细胞具有促神经元形成和血管生成作用，提高受损神经的功能。Yao R.[15]研究发现山茱萸环烯醚萜苷灌胃能降低CIRI大鼠神经功能评分，增加梗死区神经元存活数量。马钱苷作为山茱萸环烯醚萜苷的主要成分之一，探究其对CIRI的保护作用具有重大意义。本实验采用改良Longa线栓法制备CIRI小鼠模型，通过测定CIRI小鼠神经功能评分、脑梗死体积、脑含水量、脑指数等指标，观察CIRI小鼠大脑皮层和海马区的病理结构，提示马钱苷对CIRI小鼠具有良好的保护作用。

CIRI的发病机制十分复杂，主要涉及细胞凋亡、炎性反应、氧化应激、兴奋性毒性等[16]，其中细胞凋亡是研究重点之一。半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的激活是细胞凋亡的生化标志[17]，其中Caspase-3蛋白被认为是细胞凋亡的执行蛋白。Caspase-3 蛋白激活后损坏 DNA 链、破坏细胞完整性，最终形成凋亡小体，从而导致细胞凋亡[18]。作为细胞凋亡的两条重要途径，线粒体途径和内质网应激(ERS)之间紧密联系。内质网作为细胞内蛋白质合成、加工、修饰的重要场所，为线粒体提供重要蛋白保障。另外内质网作为细胞内的Ca2+库，为线粒体输送充足的Ca2+来使线粒体功能正常发挥[19]。线粒体通路中，由于氧自由基、钙离子超载等使线粒体渗透性转运孔道开放，细胞色素 C(Cyt C) 释放，活化Caspase，激活Caspase-3，导致细胞凋亡。ERS主要导致内质网腔内钙稳态失衡，出现钙剥夺或钙超载等，继而激活细胞凋亡执行分子Caspase-3，导致细胞凋亡，故可将ERS引起的细胞凋亡视作是细胞线粒体凋亡的补充途径[20]。

本实验在急性脑缺血后立即给予马钱苷治疗，其中10 mg/kg、15 mg/kg能有效减轻小鼠CIRI程度，减少神经细胞的凋亡，改善内质网与线粒体的病理形态，下调Caspase-3蛋白表达；表明马钱苷能改善CIRI小鼠神经元病理损伤，具有神经保护作用，其作用机制可能与保护神经细胞，维持线粒体和内质网结构稳态，进而下调Caspase-3蛋白相关。本实验为进一步研究马钱苷对CIRI小鼠神经保护作用提供实验依据，对开发马钱苷成为抗脑卒中临床药物奠定一定理论基础。