芪风固表颗粒对变应性鼻炎大鼠Th1/Th2/Th17细胞免疫平衡的影响

张天帅，董 坤，王伟明

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)又称过敏性鼻炎，是IgE介导的、由多种免疫细胞及相关细胞因子参与的鼻黏膜慢性炎症反应性疾病，以反复发作的鼻痒、喷嚏、流清涕、鼻塞为主要症状[1]。在中医学中，变应性鼻炎被称为“鼻鼽”，是由于人体的肺、脾、肾三脏亏虚，使正气不足、腠理开泄、营卫不固，此时风寒之邪更加容易侵袭人体，使得寒气壅滞，阳气不疏而致[2]。研究表明Th1/Th2/Th17细胞免疫失衡是AR发病的重要机制[3-5]。芪风固表颗粒是黑龙江省中医药科学院自主研发的中药新药，由黄芪、防风、炒白术、刺五加、麦冬和五味子6味中药组成，临床用于治疗肺、脾、肾虚弱所致的慢性咳嗽，是治疗表虚不固易感病症的有效药物。本研究旨在探究芪风固表颗粒对AR大鼠Th1/Th2/Th17细胞免疫平衡的影响，以进一步明确芪风固表颗粒治疗AR的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级健康成年雄性SD大鼠60 只，6～8 周龄，体质量200～220 g，购于哈尔滨医科大学实验动物学部，实验动物饲养于SPF级鼠房中，饲养环境光照适度，洁净度及通风良好，温度为(23±2)℃，湿度50%～70%。

1.2 实验药物 芪风固表颗粒：由本院制剂室提供，发明专利号：CN1325098，批准文号：国药准字B20020410，批号：20200377；地氯雷他定干混悬剂：海南普利制药股份有限公司，生产批号：2002070。

1.3 试剂 卵清白蛋白：合肥博美生物科技有限责任公司；氢氧化铝：天津市天力化学试剂有限公司；IFN-γ ELISA试剂盒：南京建成生物工程研究所；IL-4试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司；IL-17试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 仪器 BP211D型精密分析天平：Sartorius公司；DH5000型电热恒温培养箱：上海一恒仪器有限公司；Thermo Fisher Scientific型冷冻高速离心机：赛默飞世尔科技有限公司；KQ-300DB型数控超声仪：昆山市超声仪器有限公司；MS3型旋涡混匀器：德国IKA公司；MDF-382E9(N)型超低温冰箱：日本SANYO公司；iMark酶标仪：美国Bio-rad；光学显微镜：北京普瑞赛司仪器有限公司。

2 方法

2.1 模型建立及分组给药 50 只大鼠用0.3 mg卵清白蛋白加30 mg Al(OH)3混于1 mL生理盐水中，在两周内隔日1 次腹腔注射进行基础致敏；从第15 天开始进行鼻腔激发，强化致敏，每侧鼻孔各滴入50 μL浓度为100 mg/L的卵白蛋白溶液，每天滴鼻，连续7 d。造模大鼠末次鼻腔致敏后30 min内观察大鼠打喷嚏、挠鼻、抓脸、鼻溢等症状，通过计分进行模型成功与否判定，总分>5 分表示模型建立成功[6]。将模型建立成功的大鼠随机分为模型组、阳性对照组和芪风固表颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10 只。另取10 只健康大鼠为正常对照组，腹腔注射和鼻腔滴入等量生理盐水。阳性对照组予地氯雷他定(0.45 mg/kg)灌胃；芪风固表颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组予2.5、5.0、10.0 g/kg芪风固表颗粒灌胃，每日1 次，连续灌胃14 d；正常组、模型组大鼠灌胃等体积蒸馏水。

2.2 观察指标

2.2.1 鼻黏膜组织病理学观察 末次给药治疗24 h后，切取鼻黏膜，置于10%甲醛溶液中固定保存24 h后，蒸馏水冲洗，用乙醇梯度脱水处理，2 次二甲苯透明处理，浸蜡，石蜡包埋，切片机切片，置于清洁载玻片上，60 ℃恒温箱烘片，随后脱蜡、HE染色、脱水，中性树胶封片。光学显微镜观察鼻黏膜组织病理变化，并收集病理图片。

2.2.2 血清IFN-γ、IL-4、IL-17含量测定 ELISA测定。在末次灌胃24 h后，将大鼠称重，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定，暴露腹腔，进行腹主动脉采血，静置2 h后3 000 r/min离心10 min，取上清液，分装后于-80 ℃冰箱冻存。ELISA测定血清IFN-γ、IL-4、IL-17含量，按试剂盒说明书依次配置试剂标准品、清洗孔板、加样、覆膜、洗板、加显色剂终止液、酶标仪读取吸光度(OD)值，代入标准曲线，乘以稀释倍数，即得大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17含量。

2.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计分析软件进行数据分析，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠鼻黏膜组织病理学观察 模型组大鼠鼻黏膜细胞可见明显肿胀及大量嗜酸性粒细胞浸润。与模型组比较，阳性对照组、芪风固表颗粒中剂量组及高剂量组大鼠鼻黏膜细胞肿胀减轻，嗜酸性粒细胞浸润减少；芪风固表颗粒低剂量组大鼠鼻黏膜细胞肿胀及嗜酸性粒细胞浸润与模型组无异。正常组未见黏膜细胞肿胀及嗜酸性粒细胞浸润，见图1。

图1 各组大鼠鼻黏膜组织病理学观察(HE，×200)

3.2 各组大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17含量比较 见表1。

表1 各组大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17含量比较

4 讨论

中医将过敏性鼻炎称之为“鼻鼽”，是由于肺、脾、肾三脏亏虚使人体正气不足，腠理开泄，此时风寒之邪更易侵入人体，使得寒气壅滞，阳气不疏而导致的。芪风固表颗粒具有益气固表、健脾补肺益肾之功效，这与中医对过敏性鼻炎病因病机认识高度契合。芪风固表颗粒中黄芪甘微温，补中气以益肺气，实卫气而固表，白术甘温，益气健脾，二药相须为用益肺健脾固表；麦冬甘微寒，养阴清热，润肺生津，五味子酸甘，配黄芪则补固正气，伍麦冬则养阴、敛肺止咳；防风辛甘微温，走表而祛风邪；刺五加甘温，补肾益肺，纳气平喘。诸药合用，气阴同治，有润有敛，补敛合法，补中兼疏，散中兼收，共奏益气固表、滋阴益肺、健脾益肾之功。本文观察结果表明，AR模型组大鼠鼻黏膜细胞出现明显的病理损伤，且较正常大鼠血清IFN-γ含量显著降低，IL-4、IL-17含量显著增高，表明Th1/Th2/Th17细胞免疫失衡可能是AR发病的重要因素，且该发现与Song ZY等[13]发现的IFN-γ水平降低，IL-4、IL-17水平增高现象相一致。与AR模型组大鼠比较，阳性对照组、芪风固表颗粒中剂量组及芪风固表颗粒高剂量组大鼠病理损伤情况均减轻，且阳性对照组大鼠血清IFN-γ含量显著增高，IL-4、IL-17含量显著降低，芪风固表颗粒高剂量组大鼠血清IFN-γ含量显著增高、IL-4、IL-17含量显著降低，芪风固表颗粒中剂量组大鼠血清仅IL-4、IL-17含量显著降低，芪风固表颗粒低剂量组无显著变化；芪风固表颗粒高剂量的调节作用与阳对药地氯雷他定相当。表明芪风固表颗粒能够调节AR大鼠的Th1/Th2/Th17细胞免疫紊乱，恢复免疫平衡，其作用与其剂量相关，且在一定剂量范围内，呈剂量依赖性。

综上所述，芪风固表颗粒可通过调节Th1/Th2/Th17细胞免疫平衡以减轻AR大鼠病理损伤;芪风固表颗粒可有效治疗变应性鼻炎，调节Th1、Th2、Th17细胞分化是其部分作用机制。