人造鸡肉的蛋白质消化特性研究

林全全 刘璐飒 吴丽芳 蔡可腾 韩剑众

(浙江工商大学食品与生物工程学院1，杭州 310018) (杭州华测检测技术有限公司2，杭州 310018)

人类食用蛋白质来源主要是动植物性蛋白，其中，动物性蛋白的营养价值更高，但其所含的脂肪和胆固醇等对人体健康有不利影响。出于对环境可持续发展和动物福利的考虑，许多针对以动植物为食人群的肉类替代品和肉类仿真品，例如昆虫蛋白、3D打印细胞培养肉和植物基人造肉(也称植物蛋白肉或植物肉)随之产生。其中，植物肉主要由组织化植物蛋白及香辛料、色素组成[1]。组织化植物蛋白是指以植物蛋白为主要原料，以淀粉、脂肪、纤维素等为辅料，通常采用挤压法制得的类似动物肉纤维状结构和口感的蛋白产品[2]。未来植物肉或将替代部分动物肉，成为人类主要的蛋白来源之一。因此，研究植物肉的蛋白质消化吸收特性，明确其能否满足人们对蛋白质的需求具有重要意义。

目前，有关植物肉的蛋白质消化的研究报道还很少。研究表明，食品的消化特性受食品结构的影响并随食品结构的改变而发生变化[3]。挤压组织化过程中，蛋白质发生变性形成新的组织结构，其在宏观状态及微观结构上发生了较大变化。研究发现，经挤压组织化得到的植物蛋白质体外消化率高于原料蛋白质(如大豆粕、大豆浓缩蛋白)，推测蛋白质结构发生的变化(即变性及纤维状结构的形成)以及抗营养因子的降解是蛋白质消化率提高的主要原因[4,5]。目前有关植物肉中的蛋白质消化特性与植物蛋白原料及模拟的动物肉蛋白的差异，以及植物肉中的蛋白质在挤压条件下形成的纤维结构与蛋白质消化特性之间的相关性还不明确，亟待进一步研究。目前，市面上最常见的植物肉大多由组织化大豆蛋白构成。

本研究以基于组织化大豆蛋白的市售人造鸡肉为主要研究对象，比较人造鸡肉与鸡肉纤维状结构之间的差异，以及人造鸡肉与鸡肉以及大豆蛋白的消化特性，建立纤维结构与蛋白质消化特性的相关性，以期为开发高蛋白质营养价值的植物肉提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡胸脯肉；人造鸡肉(配料：大豆分离蛋白，水，淀粉，植物油，酿造酱油，白砂糖，食用盐，白胡椒；拉丝蛋白复水而成)：市售；大豆分离蛋白(SPI)。

唾液淀粉酶(10 U/mg)、胃蛋白酶(250 U/mg)、胰酶(其中的胰蛋白酶酶活为5.0 U/mg)；L-丝氨酸：分析纯；过硫酸铵(A3678)和十二烷基硫酸钠(L3771)：电泳专用试剂；牛胆盐：生化试剂。

1.2 仪器与设备

TA-XT Plus型组织分析仪，MS3000型马尔文激光粒度分析仪，KDN-816型定氮仪和HYP-320型消化炉，UV2100型紫外可见分光光度计和NE910型荧光正置显微镜。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

根据Chiang等[6]方法处理鸡肉：将鸡肉装进密封的塑料袋里，在沸水浴中煮熟至内部温度为75～80 ℃后(5～7 min)取出，室温下冷却30 min，沥干，备用。

1.3.2 水分、pH、蛋白质含量分析

水分测定参照GB/T 5009.3—2010中直接干燥法，称取2 g样品至恒重铝盒中，再放入105 ℃烘箱烘干至恒重，记录烘干前后的质量并计算样品含水量。

参考Chiang等[6]的方法测定人造鸡肉和鸡肉的pH值。使用高剪切混合器以24 000 r/min将质量分数20%样品与超纯水混合1 min后，使用pH计测量pH值。

蛋白质含量测定参照GB/T 5009.5—2010凯氏定氮法，将样品粉碎至适宜状态颗粒后称取0.3 g，利用凯氏定氮仪测定样品中蛋白质含量。

1.3.3 质构特性分析

根据耿永然等[7]的方法，采用物性测定仪(TPA模式)测定人造鸡肉和鸡肉的硬度、弹性、内聚性、咀嚼度和回复性。将样品切成1.5 cm×1.5 cm×1 cm的小块，置于测试台中央，使用P50探头，以1 mm/s的测试速度，将样品下压到原来厚度的50%，间隔时间3 s，往复2次。每个样品至少测定12次。

1.3.4 组织化度测定

根据Zhang等[8]的方法将样品切成1.5 cm×1.5 cm×1 cm的小块，置于物性测定仪测试台中央，用A/CKB探头(刀片状)以1 mm/s的速度对样品进行剪切，剪切厚度设定为样品厚度的75%，剪切宽度均为1.5 cm。切片与模头挤出方向平行时的剪切力纵向剪切力，垂直时为横向剪切力，量纲为kg。每个样品至少测定12次。组织化度的值为横向剪切力与纵向剪切力的比值。

1.3.5 微观结构分析

将样品复水沥干后切成1 cm×1 cm×1 cm的正方体后用OCT包埋在冻存盒中，用液氮速冻后取出，放在冷冻切片机上，将样品切成18 μm厚度的薄片，用载玻片吸附薄片后进行光镜观察。

1.3.6 体外消化试验

根据Brodkorb等[9]的胃肠道体外静态消化模型配方，进行前期准备工作：1)进行酶活性和胆汁浓度检测；2)制备模拟唾液(SSF)、模拟胃液(SGF)和模拟小肠液(SIF)储备液；3)进行消化预实验，确定各消化阶段pH调整所需酸和碱的添加量。

随后进行消化实验并获得消化产物，具体操作为：1)口腔阶段：采用粉碎机搅打样品模拟咀嚼。根据样品蛋白质含量分别称取搅打后的样品至50 mL锥形瓶中，保持每组样品中蛋白质含量[(0.85±0.01 g)]一致，并补充适量蒸馏水至5 g。然后，加入5 mL SSF，调整pH至7.0。添加唾液α-淀粉酶液和CaCl2，使其在最终混合物中的浓度分别达到使达到75 U/mL和0.75 mmol/L。将样品置在37 ℃轨道摇床中100 r/min下孵育2 min；2)胃阶段：将口腔消化后的食团与10 mL SGF混合，pH调整为3.0。加入胃蛋白酶，使其在混合物中浓度为2 000 U/mL，然后加入CaCl2溶液，使其在最终混合物中达到0.075 mmol/L，模拟的消化物在100 r/min的搅拌下于37 ℃水浴中孵育。分别在30、60和120 min收集胃消化食糜，分别记为SGF-30，SGF-60和SGF-120。3)小肠阶段：将模拟胃消化物与20 mL SIF混合，然后将pH值调整为7.0。加入胆汁盐和胰酶(预先溶解在SIF中)在最终混合物中分别达到10 mmol/L和100 U/mL的胰蛋白酶活性。添加CaCl2以在最终混合物中达到0.3 mmol/L。模拟的消化物在100r/min的搅拌下于37 ℃孵育。在小肠模拟消化的第30、60和120 min收集样品，分别记为SIF-30、SIF-60和SIF-120。

1.3.7 粒径测定

消化完成后，取适量样品的口腔消化产物、SGF-120和SIF-120，搅匀后立即用马尔文激光粒度仪测定粒度大小和分布。

1.3.8 可溶性氮含量测定

取各个阶段的消化产物，4 ℃下以10 000 r/min离心20 min，取上清液，利用凯氏定氮法测定样品的可溶性氮含量。同时，将未消化的原始样品与水以1∶1的比例混合，搅拌60 min，以10 000 r/min离心20 min，取上清液，利用凯氏定氮法测定未消化样品中的可溶性氮含量。

1.3.9 SDS-PAGE电泳分析

根据Tian等[10]的方法选用12%分离胶和5%浓缩胶，考马斯亮蓝G-250染色。上样液的配置：取各阶段消化产物与上样缓冲液(样品缓冲液+体积分数3%二硫苏糖醇)以1∶1比例混合，加入转子搅拌3 h至蛋白完全溶解，然后超声5 min，95 ℃水浴中加热5 min，10 000 r/min离心15 min，取10 μL上清液注入泳道，接通电源，在恒压125 V下跑胶。

1.3.10 游离氨基酸组成分析

采用L8900全自动氨基酸分析仪进行各氨基酸组分的测定。其中，未消化的样品粉末需参照GB/T 5009.124—2016方法对样品进行酸水解处理。消化产物样品经10 000 r/min离心15 min，取上清液，再加入5%磺酸水杨酸沉淀蛋白(1∶4)，用高速冰冻离心机18 000 r/min离心30 min，取上清液经滤膜(0.45 m+0.22 m)过滤后上机分析。平行测定2次，以平均值作为实验结果。

1.3.11 数据统计与分析

除特殊说明外，所有实验至少进行3次，实验结果均表示为平均值±标准差，采用Excel进行数据分析、处理和作图，各组数据中的显著性差异采用Excel中单因素方差分析进行分析。

2 结果与讨论

2.1 人造鸡肉和鸡肉的基本成分和纤维结构分析

2.1.1 人造鸡肉和鸡肉的水分、pH、蛋白质含量比较

从表1可知鸡肉的水分和蛋白质含量都明显高于人造鸡肉，pH低于人造鸡肉，可能是由于人造鸡肉的加工过程中添加了较多的淀粉、脂类等其他原料以满足其外观与口感，这些添加物直接或间接影响了其基本成分的变化。

表1 人造鸡肉和鸡肉的水分、pH及蛋白质含量

2.1.2 人造鸡肉和鸡肉的纤维结构分析

由表2可见，人造鸡肉的硬度和回复性低于鸡肉，而弹性、内聚性和咀嚼度高于鸡肉。可能由于人造鸡肉中添加较多的淀粉，淀粉的膨化作用增大了人造鸡肉组织结构间缝隙，使得其硬度和回复性较低，而弹性较高。

组织化度为横向剪切力(FV)和纵向剪切力(FL)的比值，它是纤维结构形成的指标，表现为无量纲值> 1，这是因为垂直于纤维方向切割需要更高的切割阻力，而平行于纤维方向切割则需要较低的切割阻力。由表3可知人造鸡肉的横向剪切力、纵向剪切力及组织化度均略小于鸡肉，但是无显著性差别，表明人造鸡肉能较好地模拟鸡肉的纤维结构。

表2 人造鸡肉和鸡肉的结构特性

表3 人造鸡肉和鸡肉的横纵向剪切力及组织化度

人造鸡肉和鸡肉的纤维结构光学显微图如图1所示，二者均显示出纤维状网络结构。人造鸡肉的纤维较粗，分布较为不均匀和松散，且纤维与纤维之间的间隙较大；而鸡肉的肌肉纤维较细，且分布密集均匀和规则，纤维与纤维之间的间隙较小。相比之下，Chiang等[6]报道采用大豆和小麦蛋白为主要原料制备的高水分组织蛋白的纤维比鸡肉纤维更细，连接更紧密，产生的差异可能与其组成和加工工艺有关。

图1 人造鸡肉和鸡肉的光学纤维图

2.2 人造鸡肉的蛋白质消化特性研究

2.2.1 粒径大小及变化

食品在消化过程中的粒径大小及分布变化可以反映其消化分解速度。由表4和图2可知，经过体外模拟消化，人造鸡肉、鸡肉和SPI的粒径大小均呈减小趋势，且在消化的不同阶段，3种样品的粒径均有显著性差异。口腔消化后，样品的D4,3排列顺序为人造鸡肉>鸡肉>SPI，其中，人造鸡肉和鸡肉的粒径呈双峰分布，而SPI呈单峰分布(图2)。人造鸡肉与鸡肉的粒径差异可能归因于它们自身的结构特性，食品质构会影响其咀嚼特性。通常硬度越大的食品经咀嚼得到的食糜粒径越小；硬度越小咀嚼所得的食糜粒径则越大[11]。本研究中，人造鸡肉经模拟咀嚼得到的粒径大于鸡肉，这可能是因为其硬度较小。SPI在口腔消化结束后食糜的粒径最小，这可能是因为其本身呈粉末状，颗粒较小，水溶性较好，可均匀分散在消化液中。

表4 人造鸡肉、鸡肉和SPI消化过程中粒径大小

图2 消化过程中的粒径分布

胃消化120 min后，3个样品的消化产物粒径均大大减小，这是由于经胃蛋白酶消化使得蛋白质分解成多肽和游离氨基酸。样品的D4,3排列顺序与口腔阶段一致。人造鸡肉的粒径大小和分布从口腔到胃的阶段变化最大，其次是鸡肉，SPI变化最小，这说明人造鸡肉在胃蛋白酶的作用下分解较快，大颗粒减少，但其所含大颗粒仍比鸡肉和SPI的多(图2b)。

小肠消化120 min后，三者消化产物的粒径进一步减小，这是因为在胰蛋白酶作用下，蛋白质或多肽发生进一步水解生成小肽和游离氨基酸。食糜的D4,3排列顺序与前两阶段不同，其中，SPI的D4,3值最大，人造鸡肉的最小，这说明小肠阶段人造鸡肉的消化引起的粒径变化较另两者的大，且消化产物粒径较小；而SPI的粒径变化最小，消化产物粒径较大，这可能是因为胰酶中包含淀粉酶，而人造鸡肉的组成中有淀粉。因此，在蛋白酶和淀粉酶的共同作用下，人造鸡肉在小肠阶段的粒径变化较大。相比之下，鸡肉和SPI主要以蛋白质为主，二者粒径变化较小。

结果表明，在胃肠消化过程中，人造鸡肉由于硬度较小在口腔消化阶段的粒径较大；在胃和小肠的消化过程中，相对于鸡肉与SPI，人造鸡肉的粒径变化最大，这可能与其蛋白纤维结构及组成有关。

2.2.2 消化过程中蛋白质分子量的变化

由图3比较三组样品消化前组成亚基(泳道1)可得，人造鸡肉(图3a)中可鉴定出大豆蛋白的组成亚基，包括β-伴大豆球蛋白(α、α′和β 3种亚基)、大豆球蛋白的酸性亚基和碱性亚基，进一步说明人造鸡肉的蛋白质来源于大豆。鸡肉(图3b)中出现大于97.2 ku的条带，对应鸡肉肌原纤维蛋白中的肌球蛋白的2个重链[12]，在44.3～66 ku之间存在的若干条带对应肌动蛋白。此外，鸡肉中还存在着若干分子量小于44.3 ku的条带，对应肌球蛋白的轻链和肌钙蛋白，其他条带可能是肌原纤维蛋白的碎片。SPI(图3c)中显示SPI与人造鸡肉具有相似的电泳条带。两者的条带略有差别，这可能是由于人造鸡肉中的蛋白质经过挤压加工，蛋白质发生部分聚合和分解，导致蛋白质分子量发生略微变化。

比较可得人造鸡肉、鸡肉与SPI均在胃蛋白酶的作用下，大分子量的蛋白质亚基降解为较小分子量的肽段。胃30～120 min时，SPI中大于29.0 ku的条带颜色较浅，而另两者中大于29.0 ku的条带颜色很深，说明胃消化阶段SPI的蛋白质消化程度可能较大。进入小肠消化阶段后，三者基本都水解为小于14.3 kDa的肽段和氨基酸，且SPI的条带颜色较浅，表明小肠阶段SPI的蛋白质消化可能较大。

注：泳道1～7分别代表消化前样品；胃消化30、60和120 min；小肠消化30、60和120 min图3 种样品消化过程中SDS-PAGE图谱

2.2.3 消化过程中可溶性氮含量变化

由图4可得未消化的样品中，SPI中的可溶性氮含量最高，鸡肉次之，人造鸡肉最低。人造鸡肉由大豆蛋白加工而成，其可溶性氮含量小于SPI，这可能是由于在挤压过程中，蛋白质发生一定程度的交联聚合反应，生成一些相对分子质量较大的物质，导致其不能溶解[13]，从而使得可溶性蛋白质含量降低，这与康立宁[14]的研究结果一致。

随着消化反应的进行，人造鸡肉、鸡肉和SPI中蛋白质不断降解，消化产物中可溶性氮含量均不断增加。由图4可知，胃部消化30 min和小肠消化10 min后3种样品的可溶性氮含量均显著增大，说明消化主要发生在胃和小肠的初期。胃消化期间，人造鸡肉的可溶性氮含量高于鸡肉，这与其消化前相反，说明在胃消化阶段中，基于大豆蛋白的人造鸡肉迅速消化，与鸡肉相比生成了更多的可溶性氮。这与粒径变化结果相对应，即人造鸡肉在胃部消化程度较鸡肉高，生成的可溶性氮较多，从而导致消化产物的粒径迅速减小，这可能与它们的纤维状结构及其内部的蛋白质分子结构特性有关。微观图像显示人造鸡肉的纤维较为松散，且纤维与纤维之间的间隙较大，有利于消化酶的渗入并促进消化分解。而鸡肉的纤维较细，分布较为密集，纤维与纤维之间的间隙较小，不利于消化酶的渗入，从而不利于蛋白质的消化水解。经过小肠消化10 min后，3种样品的可溶性氮含量进一步增大，随后人造鸡肉和SPI的可溶性氮含量增长缓慢并逐渐趋于平稳，而鸡肉的可溶性氮含量仍增长较快，并在小肠消化60 min后趋于平稳。在小肠消化阶段，3种样品的可溶性氮含量大小顺序为：SPI>鸡肉>人造鸡肉。三者可溶性氮含量的生成特性的差异可归因于其不同的组成及结构特性。

注：相同时间段不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。图4 人造鸡肉、鸡肉和SPI消化过程中可溶性氮含量

2.2.4 游离氨基酸组成分析

由表5可得，样品经胃部和小肠消化120 min后游离氨基酸的组成均有很大差异，但17种主要氨基酸的总量为：SPI>鸡肉>人造鸡肉，这与3组样品在小肠阶段的可溶性氮含量结果一致，可能是由于SPI是粉末状固体颗粒，大部分可溶于水，与蛋白酶的接触面积较大，蛋白质水解较彻底；而人造鸡肉是一种添加了淀粉、油脂等的大豆蛋白挤压产物，加工过程中蛋白质发生变性并形成纤维结构，可溶性蛋白含量和某些氨基酸减少。前人研究发现，挤压加工会导致蛋白质构象和结构的完整性损失，暴露出新的蛋白水解酶作用位点，减少或消除了不同的抗营养因子，从而提高大豆蛋白的消化率[15-17]。然而，本研究中的人造鸡肉蛋白质的消化程度低于大豆蛋白，可能是因为人造鸡肉中的纤维结构及存在的其他物质(淀粉、油脂等)阻碍了酶与蛋白的接触，从而降低蛋白质消化率。

表5 三组样品消化后游离氨基酸组成

3 结论

人造鸡肉与鸡肉的质构特性、组织化度较为接近，说明人造鸡肉较好地模拟了鸡肉的产品特性，但两者的纤维结构仍存在较大差异，其中人造鸡肉的纤维较粗，分布不均匀和松散，纤维之间的间隙较大；而鸡肉的肌肉纤维较细，且分布密集均匀和规则，纤维之间的间隙较小。体外消化结果显示，与鸡肉相比人造鸡肉的纤维间空隙较大，有利于消化，但其蛋白与消化酶的亲和力较小，导致生成的氨基酸较少。与原料蛋白相比，人造鸡肉中的大豆蛋白经挤压后形成的纤维状结构不利于蛋白质的消化。人造鸡肉能够模拟鸡肉的产品特性，但由于其蛋白质消化率低于鸡肉与原料蛋白质，后续还需对植物肉的结构进行调控，从而提高其蛋白质消化程度，以期获得与肉类相同的蛋白质营养价值。