超声-微波协同提取甘薯皮绿原酸及其微胶囊化工艺优化研究

蒋新龙 王 海 张玲丹

(浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015)

绿原酸是含有羧基和邻二苯酚羟基的苯丙素类有机酸[1]，是植物在有氧呼吸时经桂皮酸途径产生的苯丙素类化合物，有广泛的生物活性，在人体中具有显著的抗氧化、抗病毒、抗衰老、抗肿瘤、抑菌消炎、预防糖尿病、预防心血管疾病、防晒以及改善认知等功能[2-6]，是食品、药品、化妆品等工业的重要原料。当前生产绿原酸主要以杜仲﹑金银花等为原材料，生产成本较高。若以低廉的农产品废弃物为原料提取其中的绿原酸，不仅能有效降低生产成本，还能充分利用资源，减少环境污染。甘薯皮是甘薯食品生产过程中产生的副产物，可用于制饲料，但大多仍作为废弃物被丢掉。忻晓庭等[7]采用超声波辅助提取了甘薯皮中的多酚类物质。但迄今鲜有甘薯皮绿原酸提取的相关报道。目前，绿原酸的提取方法主要有浸提法[8]、索氏提取法[9]、超声波法[10]、微波法[11]、酶解法[12]、液膜法[13]、超临界流体萃取法[14]、半仿生提取法[15]等方法。现有方法不同程度具有步骤繁琐、操作费时、安全系数小、生产成本高、不适于大规模应用等局限性。相对而言，超声-微波法协同利用微波场的热效应和超声波的空化作用，具有工艺简单、操作方便、能耗低、效率高等优点[16,17]。因为绿原酸具由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸多酚结构[2]，其稳定性易受存储温度、氧气、pH、光照、金属离子等诸多因素的影响，使其应用受到限制。改善甘薯皮绿原酸在深度利用过程中的稳定性以及延长保质期是本领域亟待解决的技术问题。本实验借助超声-微波法从甘薯皮中提取绿原酸，并对其微胶囊化，探索其稳定性，为实际生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

甘薯皮(甘薯品种为宁紫4号红心红薯)，于65 ℃烘箱烘干，粉碎过40目筛，备用。绿原酸标准品；DPPH·；海藻酸钠(98.0%)及所用其他试剂均为分析纯；所用水为蒸馏水。

CW-2000型超声-微波协同萃取/反应仪，UV-1600型紫外可见光谱仪，AB204-N型分析天平， gZX-91400MBE 电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 绿原酸含量的测定

采用紫外分光光度法测定绿原酸含量[18]。以20 μg/mL的绿原酸为标准溶液制作标准曲线。将绿原酸标准溶液用75%乙醇配制成2.0、5.0、7.5、10.0、12.5 μg/mL系列溶液，在329 nm波长下测定其吸光度A。以吸光度A为纵轴、绿原酸质量浓度C(μg/mL)作横轴绘制标准曲线，得到吸光度A与绿原酸质量浓度C(μg/mL) 之间的回归方程为：A=0.053 1C+0.013 02，相关系数R2=0.999 9，线性范围 0～12.5 μg/mL。吸取粗提液适量，同法测其吸光值，根据回归方程计算绿原酸得率。

式中：n为稀释倍数；C为回归方程计算所得值；V为粗提液总体积。

1.2.2 绿原酸提取实验

甘薯皮+提取剂→超声-微波协同提取→抽滤→粗提液→减压浓缩→干燥→产品1，置干燥器保存备用。

超声-微波协同提取绿原酸：准确称取1.000 0 g甘薯皮粉置于专用三角瓶中，按照不同液料比加入一定浓度乙醇溶液，混合均匀，置于CW-2000 超声-微波萃取反应仪中。在超声波开启状态下(超声波功率和频率分别为50 W，40 kHz)，调节微波功率及提取时间。设置50%乙醇溶液、液料比80∶1 mL/g、微波功率100 W，提取时间25 min的条件下，采用控制变量法进行单因素实验。分别设置乙醇体积分数梯度30%、40%、50%、60%、70%；液料比梯度40∶1、60∶1、80∶1、100∶1、120∶1 mL/g；提取时间梯度为15、20、25、30、35 min；微波功率梯度为50、100、150、200、250 W，考量乙醇浓度、液料比、微波功率、提取时间四因素对绿原酸得率的影响。在单因素实验基础上，利用正交实验 L9(34)对提取条件进行优化。

1.2.3 绿原酸微胶囊制备实验

为了降低微胶囊产品工业化生产成本，参考王余梦[19]方法，采用粗提产品制备微胶囊。

制备工艺：芯材(产品1绿原酸+水，绿原酸浓度固定，实验预试5%较好)；壁材(海藻酸钠+水)；固化剂(CaCl2+水)→芯材和壁材混合均匀→向固化剂中滴入芯材和壁材混合液固化→抽滤→干燥→微胶囊(产品2)，置干燥器内保存备用。

采用锐孔法[20]，以海藻酸钠为壁材，绿原酸为芯材，包埋率为指标，固定条件为针头孔径 0.60 mm、下滴高度 8 cm[20,21]，设置海藻酸钠质量分数4%、氯化钙3%、壁芯体积比为2∶1、固化时间25 min的条件下，采用控制变量法进行单因素实验。分别设置氯化钙梯度1%、2%、3%、4%、5%；海藻酸钠质量分数2%、3%、4%、5%、6%；壁芯体积比梯度1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1；固化时间梯度为10、15、20、25、30 min，考量氯化钙浓度、包埋提取时间、壁芯体积比、海藻酸纳质量分数四因素对包埋率的影响。在单因素实验基础上，选取四因素中的三个因素为自变量，利用正交实验 L9(33)对制备条件进行优化。绿原酸包埋率B按公式计算。

式中：A为最初绿原酸原液的吸光度；V为最初绿原酸原液的体积/mL；A1为绿原酸滤液的吸光度；V1为绿原酸滤液的体积/mL。

1.2.4 绿原酸微胶囊稳定性实验

参考陈钢[22]和江滨[23]方法，将产品1和产品2分别放置于不同温度(50、60、70、80、90 ℃)的恒温箱里加热6 h，计算保存率，考察对微胶囊化前后绿原酸稳定性的影响。

1.3 统计方法及分析软件

均重复测定3次并取平均值，利用Origin8软件作图；应用SPSS20.0软件进行数据统计，并用Duncan多重比较(SSR法)检验各处理平均数之间的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 甘薯皮绿原酸提取

2.1.1 单因子实验

由图1可知，随着乙醇体积分数的增加绿原酸得率不断升高，当乙醇体积分数达到 50%时达到最大，超过50%时随乙醇体积分数的升高绿原酸得率降低。这与绿原酸极性有关，由于绿原酸含有羟基和邻二酚基的有机酸[1]，极性相比较大，因此不易被高浓度乙醇溶液提取，所以选 50%为最佳的乙醇体积分数。随着液料比的增加，甘薯皮绿原酸得率不断提高，当液料比达到 80∶1 mL/g时，乙醇溶剂的增加使得细胞内外绿原酸浓度差增大，有利于甘薯皮绿原酸的溶出，绿原酸得率都达到最大值。当液料比高于80∶1 mL/g时，液体中间部分的受热可能较难受到微波辐射，导致传热速率下降及绿原酸得率下降。故初步选取最佳液料比为80∶1 mL/g。微波功率100 W 时甘薯皮绿原酸得率最高。微波功率越大，微波对细胞膜的破坏作用越明显，分子扩散速度也越大，甘薯皮绿原酸渗出就越多。但微波功率超过100 W后，超声-微波协同瞬间热效应过于明显，使得局部温度过高导致绿原酸成分破坏，故甘薯皮绿原酸得率反而减小。随着提取时间增长，温度升高，分子运动加快，有利于甘薯皮活性成分的溶出。但提取时间达到25 min 后，绿原酸得率反而减小，主要原因是提取体系温度上升，会破坏其中的活性成分结构。

图1 提取单因素实验结果

2.1.2 正交实验

在单因素实验结果基础上，采用四因素三水平的正交实验方法，对绿原酸提取工艺参数进行优化，实验设计和结果见表1，方差分析结果见表2。

表1 正交实验设计及结果

表2 方差分析表

表1极差R表明极差影响绿原酸得率的因素主次依次排列为A>D>B>C。由表2方差分析可看出，对绿原酸得率的影响主次依次排列为A>D>B>C，方差分析和极差分析在绿原酸得率影响主次排列上完全一致。表2还可以看出，对绿原酸得率的影响液料比(A)和微波功率(D)显著，其他则不显著。直观分析，实验最优水平组合为A2B3C1D2；依据每个因素K1、K2、K3实验的最优水平组合为A2B2C2D2。Duncan法分析结果，乙醇体积分数40%和50%二水平之间差异显著，而提取时间20、25 min二水平之间差异不显著。综合分析提取成本和得率，确定最佳工艺条件A2B2C1D2，即液料比80:1 mL/g，乙醇体积分数50%，提取时间20 min，微波功率为100 W。根据最佳工艺条件A2B2C1D2进行验证实验，甘薯皮绿原酸得率分别为14.44%、14.43%、14.45%，平均为14.44%，与预测值无显著差异。

2.2 绿原酸微胶囊制备

2.2.1 单因子实验

图2 微胶囊单因素实验结果

由图2可知，甘薯皮在海藻酸钠质量分数4%，氯化钙质量分数3%，壁芯体积比2∶1，固化时间25 min时微胶囊包埋率最高。对于海藻酸钠体积分数，包埋率上升较快的在2%～3%范围，3%～4%时上升较缓，而4%～6%时包埋率下降。综合微胶囊的包埋率、成型效果和成球难易初步确定海藻酸钠质量分数为4%。随着氯化钙质量分数的增加，微胶囊包埋率呈现先上升后下降的趋势，当氯化钙质量分数为3.0%时, 微胶囊的包埋率最高。氯化钙质量分数过低，包埋不充分；氯化钙体积分数过高，外层在内层固化前形成致密的皮层，阻碍凝固剂向内层的继续扩散和内层的充分固化。壁芯体积比2∶1时微胶囊包埋率最高。当壁芯体积比低于2∶1时, 包埋率增加；当壁芯体积比高于2∶1时，包埋率缓慢降低。这可能是因为海藻酸钙包埋能力有一定限度[24]。所以壁芯体积比选择2∶1为佳。固化时间太短，氯化钙与海藻酸钠交联不充分，形成的甘薯皮绿原酸微胶囊膜薄流出，导致包埋率较低；当固化时间超过25 min，包埋率下降。可能因为氯化钙通过海藻酸钠胶囊由外向内置换Na+形成海藻酸钙需要时间，同时随着固化时间的延长，甘薯皮绿原酸在微胶囊中会由内向外扩散, 导致包埋率较低。所以微胶囊固化时间选择25 min为好。

2.2.2 正交实验

在单因素实验结果基础上，Duncan法分析固化时间25 min与其他2个水平差异显著，所以正交实验以固化时间为固定值，选取海藻酸钠浓度、氯化钙浓度和壁芯体积比3个因素为自变量，以包埋率为评价指标，利用正交实验L9(33)对提取条件进行优化。正交实验设计的因子与水平、实验设计和结果、方差分析结果分别见表3～表5。

表3 正交实验的因子与水平

表4 正交实验设计及结果

表5 方差分析表

由表4极差R可看出影响绿原酸包埋率的因素主次依次排列为：壁芯体积比(C)>氯化钙质量分数(B)>海藻酸钠质量分数(A)。由表5可以看出，对绿原酸包埋率的影响主次依次排列为：壁芯体积比(C)>氯化钙质量分数(B)>海藻酸钠质量分数(A)，方差分析和极差分析在绿原酸包埋率影响主次排列上完全一致。表5还可看出，对绿原酸包埋率的影响壁芯体积比(C)和氯化钙质量分数(B)显著，海藻酸钠质量分数(A)则不显著。直观分析，实验的最优水平组合为A1B2C2；根据每个因素K1、K2、K3实验的最优水平组合为A2B2C2。Duncan法分析海藻酸钠质量分数3%与4%二水平差异显著，所以绿原酸微胶囊化包埋最佳工艺条件为A2B2C2，即海藻酸钠质量分数4%，氯化钙质量分数3%，壁芯体积比为2∶1。根据最佳工艺条件进行验证实验，实验结果与预测值无显著差异。

2.3 绿原酸微胶囊稳定性

图3实验结果表明，绿原酸微胶囊化前后产品在不同温度(50、60、70、80、90 ℃)加热 6 h，绿原酸微胶囊的稳定性明显比绿原酸好，说明微胶囊包埋可以在一定程度上提高绿原酸的热稳定性。绿原酸微胶囊化之后也可更好地应用到食品、医疗、化妆品、饲料等领域，基本不用再考虑加工应用时如需要较长提取时间加热会使绿原酸分解的问题，可大大提高绿原酸的利用率。

图3 绿原酸微胶囊稳定性比较

3 结论

实验用超声-微波协同提取甘薯皮绿原酸，最佳提取条件：乙醇体积分数50%、液料比80∶1 mL/g、微波功率为100 W、提取时间25 min，该条件下，得率可达14.44%；微胶囊制备最佳工艺为：海藻酸钠质量分数4%、氯化钙质量分数3%、壁芯体积比 2∶1 (mL/mL，芯材质量分数5%)、针头孔径 0.60 mm、下滴高度 8 cm，此条件下包埋率可达 85.05%。绿原酸微胶囊化可以提高绿原酸的热稳定性。本研究为甘薯皮的进一步资源化开发利用提供了借鉴。