Daxx对γ射线诱导HeLa细胞凋亡的影响

唐双阳 丁 霜 申海艳 伍虹蓉 胡 煜 廖雅琪 熊雨棱 李 乐

1（南华大学病原生物学研究所 特殊病原体防控湖南省重点实验室 衡阳 421001）

2（南华大学公共卫生学院 衡阳 421001）

3（南华大学衡阳医学院 衡阳 421001）

电离辐射能通过多种信号转导通路引发细胞损伤，促进细胞凋亡［1］。有研究报道，凋亡是放射线导致肿瘤细胞死亡的主要方式之一［2］，肿瘤细胞对辐射的敏感性主要取决于辐射后细胞内的DNA损伤修复水平和辐射引发的信号转导机制，从而导致凋亡相关基因表达、细胞凋亡及细胞周期进程的改变。

人死亡结构域相关蛋白（hDaxx）是一种高度保守的多功能蛋白，能使受损DNA无法修复而使细胞发生凋亡［3-4］，从而可能促进放射治疗后肿瘤细胞的凋亡。细胞凋亡是由Caspase-8诱导的一种“细胞自杀程序”，Caspase-8不会引起组织损伤，是死亡受体介导的凋亡途径的关键启动子。Daxx在影响细胞凋亡的作用机制方面尚未完全明确。Daxx作为HIF-1a/HDAC1/Slug轴介导癌细胞浸润的抑制子，有可能成为抑制癌症转移的一个潜在的治疗靶点［5］。

课题组前期研究表明，Daxx高表达可下调宫颈癌HeLa细胞中HPV16E6蛋白对Caspase-8的抑制作用，从而促进凋亡［6］。本研究选用HeLa细胞为研究对象，通过研究过表达Daxx对经γ射线照射细胞的凋亡的影响，探讨Daxx与辐射诱导细胞凋亡之间的关系及其机制，为开辟宫颈癌放射治疗新途径提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

真核表达载体pcDNA3.1（+）/Daxx以及pcDNA3.1（+）-C1空载体由南华大学病原生物学研究所提供；改良eagle培养基（DMEM）购自Gibco公司（USA）；MTT，LipofectamineTM2000购于Invitrogen公司（USA）；鼠抗人Daxx单克隆抗体购自Santa Cruz公司（USA）；Hoechst33342、Caspase-8活性测定试剂盒购自北京Solarbio公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海联科生物公司。

1.2 细胞及细胞转染

人宫颈癌HeLa细胞株由南华大学病原生物学研究所提供。取对数生长期宫颈癌HeLa细胞，分别接种于6孔细胞培养板中，次日细胞生长至约75%时，将pcDNA3.1（+）/Daxx真核表达载体按照脂质体转染方法转染HeLa细胞，同时设pcDNA3.1（+）-C1空载体阴性转染组，加入含1%青霉素和1%链霉素的无血清细胞培养基，5%CO2、37℃培养6h，然后更换成含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基，相同条件下继续培养，用于后续实验。通过转染将HeLa细胞分为正常对照组（NC组）、空质粒转染阴性对照组（Mock组）与Daxx真核表达载体转染组（Daxx组）。

1.3 电离辐射

使用137Cs γ射线生物细胞辐照仪照射细胞，剂量率为321cGy/min，剂量分别为0Gy、2Gy、4Gy和8Gy，照后培养0h、6h、12h和24h观察细胞形态。

1.4 Western blot检测Daxx蛋白表达

转染细胞培养24h后，分别给予0Gy、2Gy、4Gy、8Gy γ射线照射，12h后收获细胞，细胞裂解，BCA法测定蛋白浓度，上样20μg蛋白行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用凝胶成像系统拍照扫描显色条带，使用ImageJ灰度扫描软件分析光密度值，检测Daxx蛋白表达水平。

1.5 MTT检测细胞增殖

细胞培养24h后，给予4Gy γ射线照射，继续培养8h后弃上清液，每孔加200μL无血清培养基及20μL MTT，37℃孵育4h后弃上清液，每孔加入200μL二甲基亚砜，置涡旋振荡器上振荡裂解10min，使蓝色结晶溶解，酶标仪测定450nm吸光度值，计算细胞增殖抑制率（PI率），检测Daxx过表达对辐照后宫颈癌细胞增殖的影响。

1.6 ELISA检测Caspase-8相对活性

细胞培养24h后，给予4Gy γ射线照射，继续培养12h后，收集细胞并裂解，取上清液，经酶标仪测定样品。Caspase水解底物的pNA吸光度为样品A405减去空白对照A405。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

将密度为5.0×105mL-1的细胞培养于含有盖玻片的24孔培养皿中24h，4Gy γ射线照射，继续培养6h，加入终浓度为10μg/mL的Hoechst33342，37℃孵育30min，固定封片，于荧光显微镜下观察。

培养转染细胞于CO2细胞培养箱中孵育24h后，给予4Gy吸收剂量照射，照射结束后继续培养6h，离心收集细胞，按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书避光染色，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.8 统计学分析

使用SPSS19.0统计软件完成实验数据分析，采用GraphPad Prism5软件绘图，计量资料结果以（xˉ±s）表示，两组间样本均数比较采用t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，p＜0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 辐照细胞的形态观察

生物显微镜观察经0Gy、2Gy、4Gy和8Gy γ射线照射的宫颈癌细胞形态。辐照后6h各辐射组细胞均出现不同程度的形态异常，随着吸收剂量增加，细胞数量逐渐减少，部分细胞变圆，细胞间隙加大；随着照后时间的延长，各辐射组细胞数量逐渐减少、变形、皱缩，漂浮细胞逐渐增加；其中4Gy照射组在辐照后12h，出现少部分细胞皱缩、变形，8Gy组在辐照后12h，已少见正常形态细胞，大部分细胞皱缩、变形（图1）。

图1 显微镜观察辐照细胞形态Fig.1 Morphology of irradiated cells observed by microscope

2.2 辐照细胞中Daxx的表达

收取经0Gy、2Gy、4Gy和8Gy γ射线照射后12h的细胞，经Western blot检测细胞中Daxx的表达水平，Daxx表达水平随着吸收剂量增加而升高，4Gy组、8Gy组与0Gy组比较，差异均有统计学意义（p＜0.05，p＜0.01）（图2）。表明Daxx表达水平与吸收剂量相关。

图2 辐照细胞中Daxx的表达：(a)各组的Western blot条带图;(b)各组的蛋白表达水平；★p＜0.05，★★p＜0.01Fig.2 Expression of Daxx protein in irradiated cells:(a)representative Western blot for protein expression;(b)densitometry analysis of protein levels;★p＜0.05,★★p＜0.01

2.3 Daxx对辐照细胞增殖的影响

MTT检测辐照12h后细胞的增殖情况，以未辐照组为对照，计算各实验组细胞增殖抑制率。转染Daxx的辐照细胞组明显高于其对应的未辐照组、空质粒辐照组以及正常细胞辐照组，差异均有统计学意义（p＜0.01）（图3）。提示Daxx有利于辐照导致的细胞增殖抑制。

图3 MTT检测Daxx对辐照细胞的增殖抑制的影响；★★p＜0.01Fig.3 Proliferation inhibition of Daxx protein on irradiated cells by MTT;★★p＜0.01

2.4 Daxx对辐照细胞Caspase-8活性的影响

ELISA检测辐照后12h各组细胞的Caspase-8相对活性。转染Daxx的辐照组细胞的A405值明显高于其对应的未辐照细胞组、空质粒辐照组以及正常细胞辐照组，差异均有统计学意义（p＜0.05）（图4）。提示Daxx能增强辐照细胞Caspase-8的相对活性。

2.5 Daxx对辐照细胞凋亡的影响

荧光显微镜观察辐照12h后细胞的凋亡。辐照组核固缩细胞的比例高于未辐照组，其中转染Daxx的辐照组核固缩细胞最高（图5）。

图5 荧光显微镜观察辐照细胞凋亡形态Fig.5 Apoptotic morphology of irradiated cells observed by fluorescence microscope

流式细胞术检测发现，转染Daxx的辐照组的细胞凋亡率明显高于其对应的未辐照组、空质粒辐照组以及正常细胞辐照组，差异均有统计学意义（p＜0.05）（图6）。提示Daxx参与辐照细胞的凋亡。

图6 流式细胞术检测Daxx对辐照细胞凋亡的影响：(a)各组的代表性流式细胞图；(b)各组的凋亡率；★p＜0.05Fig.6 Daxx protein on apoptosis of irradiated cells detected by flow cytometry:(a)representative flow cytometry data;(b)apoptotic rate;★p＜0.05

3 讨论与结论

放射治疗已经成为治疗宫颈癌的主要手段之一，约80%的宫颈癌患者接受单独或联合的放射治疗，尤其对不能手术的Ⅱ期以下或晚期宫颈癌患者，可取得较为理想的效果。Daxx在细胞中的不同表达情况有可能导致细胞的生长与凋亡不同。有研究认为，Daxx在胰腺神经内分泌肿瘤组织病变中出现基因突变［7］或表达缺失［8］；在泌尿道上皮组织癌细胞中，Daxx的分布区域及其核分布区域的大小都有变化［9］；食管鳞癌组织内Daxx的定位和表达与临床患者的生存指数密切相关［10］。

本研究结果显示：Daxx表达水平随着吸收剂量增加而升高，由此推测Daxx参与细胞中辐照引发某些生物学效应；而过表达Daxx能明显上调辐照细胞的Caspase-8活性，促进细胞凋亡。有研究表明：增强Caspase-8与Fas-Daxx之间的相互作用能促进细胞凋亡［11］。Caspase-8是Fas/FasL系统的重要效应子。经典的Fas诱导的细胞凋亡途径是Fas受体通过FADD-Caspase-8通路及其下游的Caspase家族成员而实现的。因为FADD（Fas相关死亡结构域）能够与Caspase-8（或-10）前体蛋白结合形成死亡诱导信号复合物（DISC），激活Caspase-8（或-10），进一步激活Caspase级联，导致细胞凋亡［12］，故Daxx通过与Fas受体结合，激活级联酶，诱导细胞凋亡［13］。有研究表明：在辐射条件下，γ干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）可通过上调Daxx表达而抑制盒配对基因3，从而诱导自噬，增加人黑色素瘤细胞死亡［14］。Daxx对0.7Gy电离辐射诱导的肿瘤也具有抑制作用［4］。高表达果蝇的Daxx样蛋白，能有效通过Daxx-ASK1-JNK途径诱导凋亡，而该蛋白的缺失增强了对氧化应激以及UV照射的抵抗作用［15］。然而，也有研究认为，在卵巢癌细胞中过表达Daxx能保护癌细胞免受X射线以及化疗诱导的DNA损伤，促进癌细胞增殖，增强癌细胞对放疗与化疗等的抵抗性［16］。

综上所述，在宫颈癌HeLa细胞中，Daxx能够促进经γ射线照射的细胞凋亡，其作用机制可能是在辐照细胞内，Daxx通过正反馈Caspase-8活性，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，具体的作用机制还有待进一步研究。