花生茎叶酚酸的提取纯化及其抗氧化活性研究

孔秀琴 赵雅静 鉏晓艳 李海蓝 邱建辉

1（兰州理工大学石油化工学院 兰州 730000）

2（湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所 武汉 430064）

辐照提取主要利用60Co γ射线携带的能量使生物大分子发生降解，是一种节能、环保、高效的提取方法，控制好吸收剂量，可以有效提取目标物质［1-2］。目前，辐照辅助植物降解的研究集中于秸秆和草药的辐照预处理中。武小芬等［3］发现400kGy γ射线处理能够破坏稻草木质纤维结构，将大分子物质降解成水溶性组分。张勇等［4］采用800kGy γ射线处理玉米秸秆，再进行糖化发酵，可有效提高乙醇转化率至55.9%。龙金花等［1］发现五倍子粉末经800kGy γ射线处理后再进行热水提取，可提高单宁酸得率至65.13%。Song等［5］发现黑人参水提物经100kGy γ射线辐照后，还原糖含量提高，对DPPH自由基、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 （2，2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自 由基的清除作用显著增强。以上方法多数利用60Co γ射线辐照预处理植物粉末，再进行溶剂提取，使用的吸收剂量较高，处理时间较长。本实验室使用液体辐照提取法，通过低剂量（5kGy）60Co γ射线辐照三氯甲烷提取物，成功获得花生茎叶（Arachis hypogaeaL.stems and leaves，AHSL）生物碱类物质，并提高了提取效率［6］。

AHSL是一种优良的中草药［7］，目前主要用于治疗各种原因引起的睡眠紊乱［8-9］、焦虑症［10］等。Deng等［11］研究显示，AHSL的乙酸乙酯和石油醚萃取物中富含生物碱、黄酮类及苷类物质，能够通过对多巴胺信号通路的6种神经递质实施有效干预，进而降低小鼠自主活动能力。Zu等［12-13］研究表明，AHSL水提物中的芳樟醇、1-辛烯-3-醇等可提高大鼠大脑中的腺苷酸和三磷酸腺苷水平，通过γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）调控路径改善失眠大鼠的睡眠行为。Cossetin等［14］研究表明，大鼠口服AHSL醇提物1000mg/kg28d以上，其血液生化参数、体重和运动协调性均无变化，认为AHSL醇提物是安全无毒的。以上研究主要集中于AHSL镇静催眠成分的提取、功效验证及动物安全性中，关于其酚酸类物质的提取及抗氧化作用的研究较少。酚酸属于多酚类物质，是分子中具有羧基和羟基的芳香族化合物［15］，不能由人和动物体自身合成，但可以多种形式存在于植物中，如AHSL含有阿魏酸等酚酸类物质［11］，具有抗氧化、抗肿瘤、消炎杀菌等多种药理学作用［16-17］。

本文以AHSL为原料，利用60Co γ射线辐照结合乙醇同步萃取的方法提取AHSL酚酸类物质；采用响应面法优化提取工艺参数，有机溶剂法进一步萃取纯化，并对获得的AHSL酚酸的抗氧化性进行系统研究，为花生茎叶的高值化利用和深度开发提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

AHSL，湖北省荆门市楚花花生加工专业合作社提供，取落花生根部以上枝叶部分，清洗后50℃干燥24h至恒重，粉碎并通过孔径0.425mm的筛，即得AHSL粉末。茶多酚、无水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、FeSO4、水杨酸、铁氰化钾等，分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供；1，1-二 苯 基-2-三 硝 基 苯 肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、没食子酸标准品（纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

60Co γ射线辐照源（装源量9.435×1015Bq，放射活度1.11×1016Bq），湖北省辐照实验中心；紫外可见光分光光度计UV-2800，尤尼柯上海仪器有限公司；冷冻干燥机LGJ-25C，北京四环科学仪器厂有限公司；分析天平BAS224S，赛多利斯科学仪器有限公司；高速离心机TGL-1601，上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 吸收剂量对酚酸得率的影响

称取10g AHSL粉末6份置于密封袋中，分别加入300mL50%乙醇，密封袋封口后送至湖北省辐照实验中心进行辐照，吸收剂量分别设为0kGy、2kGy、4kGy、6kGy、8kGy、10kGy。辐照过后样品抽滤浓缩，冷冻干燥后进行酚酸含量检测，每组3个平行。样品实际吸收剂量用重铬酸银剂量计（自制玻璃安瓶剂量计，其中低剂量量程含重铬酸银0.35mmol/L，高剂量量程含重铬酸银2.5mmol/L）进行标定，剂量计常温保存，跟随样品辐照后送湖北省辐照工程中心进行剂量检测，得实际吸收剂量分别为0kGy、2.15kGy、3.62kGy、6.30kGy、8.26kGy、9.73kGy。

1.3.2 液料比对酚酸得率的影响

称取10gAHSL粉末5份，分别加入50%无水乙醇100mL、200mL、300mL、400mL、500mL，按§1.3.1 获得的最优剂量进行辐照，然后抽滤并浓缩。获得的液体冷冻干燥后进行酚酸含量检测，并计算酚酸得率。每组设置3个平行。

1.3.3 乙醇浓度对酚酸得率的影响

称取10g AHSL粉末6份，按§1.3.2 获得的最优液料比分别加入0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇，按§1.3.1 获得的最优剂量进行辐照，然后抽滤并浓缩，获得的液体冻干后进行酚酸含量检测并计算酚酸得率。每组设置3个平行。

1.3.4 AHSL酚酸提取工艺优化

与单因素试验结果相结合，采用Box-Behnken中心组合试验设计，以酚酸得率为响应值，采用Design-Expert10.0.4 进行吸收剂量、乙醇浓度、液料比3个因素的二次响应面模型实验，优化AHSL酚酸提取工艺。

表1 响应面分析因素与水平Table1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.5 AHSL酚酸的纯化

采用氯仿和乙酸乙酯对辐照后乙醇提取物中的AHSL酚酸进行萃取纯化。方法1：用乙酸乙酯萃取，再用等体积氯仿萃取乙酸乙酯相，取上层液旋蒸后冻干得到萃取物，记为EC。方法2：用氯仿萃取，再用等体积乙酸乙酯萃取氯仿相，取上层液旋蒸后冻干得到萃取物，记为CE。进行酚酸含量测定，比较酚酸含量较高的方法，进行萃取次数对酚酸含量的影响实验，获得物浓缩冻干后即为AHSL酚酸。残余物浓缩冻干后备用，响应面优化工艺后的乙醇提取物（Ethanol extracts）设为对照组，记为EE。

1.3.6 AHSL酚酸抗氧化性研究

准确称取0.2g EE、AHSL酚酸和残余物粉末，用蒸馏水定容至100mL，得到浓度为2mg/mL的溶液，分别吸取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、3.5mL、5.0mL、7.5mL溶液，定容至50mL，得浓度依次为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、140μg/mL、200μg/mL、250μg/mL和300μg/mL的样品，测定不同浓度样品对DPPH自由基、羟基自由基的清除能力及其铁离子还原力。配制等浓度的茶多酚溶液为对照。

1.4 指标测定

1.4.1 AHSL酚酸得率及含量测定

取没食子酸对照品溶液2μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、8μg/mL各1mL，加无水乙醇，再加0.3%十二烷基硫酸钠溶液、0.6%三氯化铁和0.9%铁氰化钾（1∶0.9）混合溶液，混匀，在暗处放置5min，用0.1mol/L盐酸溶液定容至25mL，以显色剂为空白，在736nm处测定吸光度［18］，得 到 标 准 曲 线y=106.3x+0.0283（R2=0.9999）。取1mL样品，按上述方法进行吸光度检测，按式（1）计算AHSL酚酸得率Y（%），按式（2）计算酚酸在萃取物中的质量浓度（cm，μg/mL）。

式中：c0为标准曲线上查得的样品浓度，μg/mL；v0为样品体积，mL；m0为AHSL样品质量，mg。

式中：c为从标准曲线上查得的样品浓度，μg/mL；n为样品稀释倍数。

1.4.2 AHSL酚酸对羟基自由基的清除作用

在试管中依次加入1.8mmol/L FeSO4溶液1mL、1.8mmol/L水杨酸-乙醇溶液1mL、样品液1mL和0.03%H2O2溶液1mL，在37℃恒温水浴锅中反应30min后，以蒸馏水为参比，在510nm下测定样品吸光度值，按式（3）计算AHSL酚酸对羟基自由基的清除率K1（%）。

式中：A0为样品液换为蒸馏水后的吸光度值；Ax为加入样品液的吸光度值；Ax0为H2O2溶液换为蒸馏水后的吸光度值。

1.4.3 AHSL酚酸对DPPH自由基的清除作用

根据参考文献方法［19］，在试管中依次加入3.5mL6.5×10-5mol/L DPPH溶液和0.5mL样品液，混合摇匀，在室温下反应20min，以3.5mL无水乙醇加上0.5mL60%乙醇调零，在517nm处测定样品吸光值，按式（4）计算AHSL酚酸对DPPH自由基的清除率K2（%）。

式中：A0为将样品液换为60%乙醇的吸光度值；As为加入样品液的吸光度值；Ar为DPPH自由基换为无水乙醇的吸光度值。

1.4.4 AHSL酚酸还原能力测定

在试管中分别加入适量的样品液、pH为6.6的磷酸盐缓冲溶液以及1%的铁氰化钾溶液，混合摇匀后，在50℃恒温水浴锅中水浴30min，冷却至室温，加入10%三氯乙酸溶液，混合摇匀，4000r/min离心10min，移取上清液至另一试管中，加入蒸馏水和0.1%的三氯化铁溶液，摇匀后在室温下静置10min，在700nm处测吸光度值，以不加样品液为参比［20］。

1.5 数据处理

运用Microsoft Excel2007和OriginPro8.5对实验数据进行处理和绘图，各数据以“平均值±标准差”表示。运用Design-Expert10.0.4 软件进行响应面多元回归拟合和方差分析，运用SPSS20.0软件中单因素ANOVA程序进行统计学分析，p＜0.05，即为统计学差异显著。

2 结果与讨论

2.1 吸收剂量、乙醇浓度和液料比对酚酸得率的影响

由图1（a）和（b）可知，随着吸收剂量和乙醇浓度的增加，酚酸得率呈现先升高后降低的趋势，乙醇浓度为60%时，AHSL酚酸得率显著高于其他各组（p＜0.05）。当吸收剂量为6kGy时，酚酸得率达到（2.09±0.03）%，显著高于对照组（p＜0.05）。原因可能为γ射线作用于溶剂体系（乙醇和水）产生了大量·OH、·H等自由基，自由基攻击大分子物质促进其氧化或者降解［6，21］，使得植物细胞中酚酸类物质溶出；吸收剂量过大，酚酸类物质的羧基和羟基在自由基氧化作用下转化成醛或酮，导致AHSL酚酸得率下降。由图1（c）可知，酚酸得率随液料比而升高。当液料比为30∶1（mL∶g）时，AHSL酚酸得率最高，此后无法再显著增加，这可能与单位质量AHSL中该类酚酸含量的极限值有关。

图1 不同吸收剂量（a）、乙醇浓度（b）和液料比（c）下的AHSL酚酸得率（不同小写字母代表组间差异达显著水平p＜0.05）Fig.1 Yields of AHSL phenolic acid under different absorbed doses(a),ethanol concentrations(b),and ratios of ethanol to AHSL(c)(The different lower-case letters mean significant at p＜0.05)

2.2 响应面实验设计及方差分析

响应面试验设计及结果如表2所示。通过多元回归拟合分析得出吸收剂量（A）、乙醇浓度（B）和液料比（C）对AHSL酚酸得率（Y）的影响。用二次多项回归方程表示为Y=2.16＋0.11A＋0.054B-0.016C＋0.13AB＋0.050AC-0.087BC-0.29A2-0.13B2-0.075C2。方差分析结果见表3，其中响应面回归模型p＜0.01，表明该模型具有显著性。R2=0.9474，调整决定系数R2Adj=0.8798，说明该模型能解释87.98%响应值的变化。根据p值，对AHSL酚酸得率具有显著性影响的因素有吸收剂量、乙醇浓度及两者的交互因素。

表2 响应面分析试验设计及结果Table2 Experimental design and results of response surface analysis

表3 方差分析结果Table3 Results of ANOVA

2.3 双因素交互作用分析

图2表示因素两两交互作用对酚酸得率的影响。总体而言，随因素值的增加，酚酸得率呈先上升后下降的趋势。从响应面图的陡峭程度和等高线密度可直观反映出两因素交互作用的强弱［22-23］，图2中，吸收剂量与乙醇浓度的曲面比较陡峭，交互作用对酚酸得率的影响较强（p=0.0091＜0.01）；乙醇浓度与液料比曲面比较平缓，等高线密度较低，两者交互作用对酚酸得率的影响不显著（p=0.0538）。此外，根据等高线图，沿着吸收剂量移动的等高线密度，明显高于沿着乙醇浓度或者液料比移动的等高线密度，说明吸收剂量对响应值的影响最为显著，这与数据结果一致（p=0.0001＜0.01）。

图2 吸收剂量与乙醇浓度(a)，(b)；吸收剂量与料液比(c)，(d)；乙醇浓度与料液比(e)，(f)对酚酸得率影响的响应面图和等高线图Fig.2 Response surface map and contour map of the effects between absorbed dose and ethanol concentration(a),(b);absorbed dose and ethanol∶AHSL(c),(d);and ethanol concentration and ethanol∶AHSL(e),(f)on the yield of phenolic acid

通过响应面实验分析预测酚酸提取的最优参数：吸收剂量6.57kGy，乙醇浓度69.39%，液料比26.43∶1（mL∶g），在此条件下AHSL酚酸得率可达2.23%，高于生木瓜的1.58%［18］。为方便实际操作，将提取条件进行修正，分别为实测吸收剂量6.70kGy，乙醇浓度70%，液料比27∶1（mL∶g），以此条件进行提取得到的AHSL酚酸得率为（2.25±0.11）%，与理论预测值仅相差0.9%。

2.4 萃取方式对酚酸含量的影响

根据图3，酚酸含量随着乙酸乙酯萃取次数的增加而显著增加（p＜0.05），CE3中的酚酸含量可达到（85.19±8.54）μg/mL，是对照组（EE组）的1.80倍。AHSL中含有较多的甾醇类物质［24］，而氯仿对甾醇有较好的萃取作用［25］。因此先用氯仿萃取出大部分甾醇，再用乙酸乙酯萃取可得到较高的酚酸类物质。

图3 不同萃取方式下的酚酸含量（不同小写字母代表组间差异达显著水平p＜0.05）Fig.3 Concentration of phenolic acid obtained from different extraction methods(The different lower-case letters means significant at p＜0.05)

2.5 AHSL酚酸抗氧化效果

由图4可知，对自由基的清除作用和对铁离子的总还原力由大到小均为AHSL酚酸、乙醇提取物EE和残余物。随着添加物浓度的升高，AHSL酚酸对两种自由基的清除作用逐渐增强，当浓度为100μg/mL时，可以清除50%以上的DPPH自由基和羟基自由基。与其他植物提取物相比，AHSL酚酸对DPPH自由基的清除率高于艾叶精油和艾叶乙醇提取物［26］，对羟基自由基的清除率高于山茱萸叶提取物［27］，且AHSL酚酸对由H2O2/Fe2+体系反应产生的羟基自由基的清除作用与同浓度的茶多酚无显著性差异（p＞0.05）。在总还原力方面（图4（c）），随着添加物浓度的升高，各组对铁离子的还原作用逐渐增强，而残余物对铁离子基本无还原能力。酚酸类化合物主要分为C6-C1型和C6-C3型，化学结构上均含有苯环和酚羟基［28］，其分子中氢原子供体的脱氢能力、电子给体的自由基淬灭能力对其抗氧化活性有很大影响［29］。根据本文研究结果，AHSL酚酸除了文献报道的阿魏酸［11］外，还含有较多的没食子酸。有研究表明，没食子酸C1位和阿魏酸C2位O-H键的解离焓较低，OH键断裂释放的氢易与活泼基团或自由基发生反应［30-31］。此外，该两种酚酸分子中电子转移的电离势较低，可提供多余电子直接淬灭自由基和加速铁离子还原反应［16，32］。因此AHSL酚酸表现出较强的抗氧化能力。

图4 AHSL酚酸对DPPH自由基（a）、羟基自由基（b）和总还原力（c）的影响Fig.4 Effects of AHSL phenolic acid on DPPH free radicals(a),hydroxyl radicals(b),and ferric reducing power(c)

AHSL富含的酚酸类物质具有抗菌、抗癌、抗炎等保健作用［28］，对进行高效提取可增加其作为药物开发的潜力，并促进我国AHSL等农业副产物资源的可持续利用。60Co γ辐照技术，利用γ射线携带的大量能量可使植物大分子发生电离效应［5］，加速植物细胞中目标活性物质的溶出与提取［1-2，6］。本文采用60Co γ辐照结合有机溶剂的方法提取AHSL酚酸，与传统浸渍法、渗漉法、热回流提取法等［33］相比，具有能耗低、时间短、处理高效等优点，有利于工业规模化生产，应用前景广阔。

3 结论

经响应面优化，AHSL酚酸提取的最佳工艺参数为吸收剂量6.70kGy，乙醇浓度70%，液料比27∶1（mL∶g），在此条件下，AHSL酚酸得率可达（2.25±0.11）%。工艺条件中，吸收剂量对AHSL酚酸得率的影响最为显著（p=0.0001＜0.01）。氯仿和乙酸乙酯可以很好地萃取纯化AHSL酚酸，含量可达萃取前的1.80倍。AHSL酚酸的抗氧化性显著高于乙醇提取物和残余物，对羟基自由基的清除作用与同浓度的茶多酚无显著性差异；AHSL酚酸浓度为100μg/mL时，可以清除50%以上的DPPH自由基和羟基自由基。该提取和纯化工艺可为花生茎叶的进一步开发利用提供新的思路。