米曲霉脂肪酶富集浓缩裂殖壶藻油脂中DHA的机理研究

傅新媛 黄林洁 刘思彤 邵雅婷 王 芳,2 邓 刚

(浙江省特色经济植物生物技术研究重点实验室；浙江师范大学化学与生命科学学院1，金华 321004) (浙江师范大学行知学院理学院2，兰溪 321100)

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid, DHA)，是一种常见的Omega-3型多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)，通常认为它对人的智力及视神经的发育起着至关重要的作用[1，2]，而被广泛用于乳制品、营养保健品等领域，近年来我国DHA的市场规模不断扩大，总市值已达到360亿元[3]。目前DHA主要来源是鱼类和微藻[4，5]，鱼油中DHA含量较低，仅为10%左右，而微藻脂质中DHA含量因藻种和培养方式而异，最高可达40%。由于上述原料常含有色素及其他饱和脂肪酸等杂质，DHA含量低且在脂质中存在形式呈现多样化，导致产品具有异味、易酸败等问题，因此对油脂进行提纯除杂，获取高纯度、甘三酯型DHA产品，不仅可以提高产品品质，增加附加值，而且将极大地提高DHA类产品的稳定性，延长货架期。因而，随着国内外对高浓度PUFAs的需求持续增加，富集浓缩天然油脂中DHA的研究已经引起人们广泛关注。

传统的DHA富集浓缩方法有尿素包合法[8，9]、低温结晶法[10，11]等。尿素包合法是尿素在体系中能包合短链饱和脂肪酸，而不能包合长链的不饱和脂肪酸，构象复杂的DHA多被富集在溶液中[12]。低温结晶法是低温条件下，由于脂肪酸分子量存在差异，因而结晶能力有所不同，分子量大、不饱和程度高的DHA在溶剂中不易结晶，被富集在清液中[13]。以上两种方法选择性较低，且需要大量使用有机溶剂，随着国家可持续发展战略的实施，需要开发环境友好型的工艺取代传统老旧工艺迫在眉睫，近年来各类酶法浓缩DHA新工艺，因其条件温和、能效率高等优点正逐渐受到关注。已有研究表明，部分脂肪酶对底物甘三酯甘油骨架上酯键的水解具有区域选择性(Regioselectivity)，Gao等[14]研究发现产自浅紫链霉菌(Streptomycesviolascen)的脂肪酶仅能水解鳕鱼肝油甘三酯甘油骨架sn-1,3位上的酯键，使得sn-2位上的脂肪酸被保留，DHA能在单甘脂和甘二酯中被富集。另一类是脂肪酶对底物甘油三酯甘油骨架上相连的脂肪酸水解具有选择性(Acyl Chain Specificity)，Chen等[15]采用脂肪酶法对鳕鱼肝油进行水解，发现皱褶假丝酵母脂肪酶(CandidarugosaLipase)对骨架上短链脂肪酸(C18或以下)表现出特异性选择，会优先水解饱和和单不饱和脂肪酸，最后水解PUFAs，使得DHA能在甘油酯中富集。由此可见，采用脂肪酶法富集浓缩DHA主要是依赖于脂肪酶对底物水解的特异性选择，除了筛选价格低廉、催化效率高的脂肪酶，更重要的是必须深入了解各类脂肪酶催化反应机制，探究富集浓缩DHA的原理，为实际应用提供理论依据。本次研究采用产自米曲霉(Aspergillusoryzae, AO)的游离脂肪酶对裂殖壶藻油脂进行水解，经薄层层析法分离回收了酶解产物中脂质，并结合气相色谱对各脂质中脂肪酸组成及DHA含量进行了分析，通过核磁共振碳谱(13C-NMR)进一步考察酶解产物中甘三酯甘油骨架上脂肪酸的位置分布，从而阐明了AO脂肪酶催化水解反应机制及富集DHA的原理。

1 材料与方法

1.1 材料

裂殖壶藻油，以裂殖壶藻(Schizochytrium sp.)为菌株发酵后提取所得，DHA质量分数为35.1%。AO脂肪酶产自米曲霉(Aspergillus oryzae)，酶活力300 000 U/g。

1.2 试剂与仪器

氘代氯仿(CDCl3, 氘代度99.8%+0.03%TMS)；异辛烷为色谱纯；二氯甲烷、正己烷、乙醇等试剂均为分析纯。7820A气相色谱仪，AVANCE III 600MHz核磁共振谱仪，BSA224S电子天平，ZWY-2102C恒温摇床。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶水解裂殖壶藻油脂

脂肪酶水解实验采用多批次反应，批次间相隔4 h，每批次对应一个反应时间，设置2个重复的实验组和1个对照组。在每组实验中，100 mL锥形瓶中加入10.0 g裂殖壶藻油脂、10.0 mL 0.1 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲溶液，混合均匀，实验组加入0.2 g AO脂肪酶，对照组则加入相同量的已灭活的酶，充入氮气，封口后置于40 ℃、130 r/min恒温摇床上进行反应。

1.3.2 薄层层析法分离酶解产物中脂质

反应进行到设定时间后，分别取出该批次实验组和对照组的锥形瓶，放入沸水浴5 min，灭酶，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，取出上清液，采用GF254型硅胶板(中国青岛海洋化工有限公司)进行薄层层析(Thin Layer Chromatography, TLC)，甘油酯混合标准品为三油酸甘油酯(97%, 中国卡尔玛实验科技有限公司)。分别取10.0 mg和60.0 mg待测液溶于二氯甲烷中，对5 cm×7 cm小板和20 cm×10 cm大板进行点样，展开剂为正己烷-无水乙醚-冰乙酸(70∶30∶0.5)，层析完成后冷风吹干，碘蒸汽显色，小板用于脂质组成分析，大板则进一步刮下显色条带，分别置于10 mL离心管中，用5 mL二氯甲烷超声浸提各条带粉末2～3次，合并上清液，氮吹脱除溶剂后，准确称量各条带中脂质质量，计算脂质回收率。

1.3.3 气相色谱测定脂质中DHA含量及脂肪酸组成分析

称取60.0 mg上述回收得到的脂质样品，溶于4.0 mL异辛烷，加入200 μL 2 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，反应10 min，继续加入1.0 g硫酸氢钠，震荡混匀，静置分层后，上清液移至样品瓶中。采用气相色谱进行脂肪酸组成分析，并采用外标法[16]测定了各脂质中DHA的含量，色谱条件如下：毛细管色谱柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，载气为N2(纯度>99.99%)，流速1 mL/min。样品进样量为1 μL，分流比为1∶100，进样口和检测器温度分别设定为270 ℃和280 ℃。采用升温程序：初始柱温为100 ℃，保持10 min；以10 ℃/min升温至180 ℃，保持6 min；继续以1 ℃/min升温至200 ℃，保持20 min；再以4 ℃/min升温至230 ℃，保持10.5 min。

1.3.4 核磁共振技术分析甘油三酯的甘油骨架上脂肪酸分布

核磁共振碳谱(Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectrum,13C-NMR)分析酶解产物中甘油三酯的甘油骨架上脂肪酸分布。取50 mg TLC法分离回收得到的甘三酯到样品瓶中，加入0.6 mL氘代氯仿溶解，转移至核磁管中用于分析。13C-NMR条件：谱宽为36 057.69 Hz，90°脉冲宽度为12.0 ms，弛豫时间为2 s，采样点数为65536，扫描次数为200，空扫为4。碳谱的化学位移以四甲基硅烷(TMS)为标准校正，并利用MestReNova软件对图谱进行处理并分析[17，18]。

2 结果与分析

2.1 底物和不同反应时刻的产物脂质分离及组成分析

图1 底物及不同反应时刻产物的脂质分离及组成分析

图2 AO脂肪酶催化水解甘油三酯的反应过程

裂殖壶藻油脂经AO脂肪酶催化进行了水解反应，采用薄层层析法对底物S和不同反应时刻的产物P1-P5进行了脂质分离及组成分析，结果如图1所示。由图1可知，裂殖壶藻油脂作为底物，主要由甘油三酯(Triglyceride, TAG)和甘油二酯(Diglyceride, DAG)组成，随着反应进行，TAG首先被水解生成DAG，进而生成单甘脂(Monoglyceride, MAG)，释放游离脂肪酸(Free fatty acid, FFA)，其反应机理如图2所示。该水解反应共持续了16 h，间隔4 h取样进行TLC分析，随着反应的进行，TAG的样点逐渐变小，颜色变浅，而DAG样点则逐渐变大，颜色加深，并且可观测到新产生的MAG和FFA的样点，结果表明通过TLC脂质分析，不仅可以判断酶解反应是否正常，而且可以监测反应过程中产物中的脂质组成变化，但尚不能明确各脂肪酸在脂质中分布情况。

2.2 脂肪酶水解裂殖壶藻油脂反应动力学分析

采用TLC法对不同反应时间下酶解产物中脂质进行分离并回收，精确称量了各脂质的质量，通过气相色谱法测定了各脂质中DHA的含量，与对照组进行了比较，结果如表1所示。反应前60 mg底物共回收得到47.2 mg TAG和7.3 mg DAG，未检测到MAG和FFA的存在。随着酶解反应的进行，与对照组相比，产物中TAG含量逐渐下降，DAG含量则显著增加，并且产物中出现了MAG和FFA，同时TAG中DHA含量逐渐升高，反应12 h后，TAG总转化率达47.7%，TAG中的DHA质量分数升至55.43%。

表1 酶解反应产物中脂质的回收率及各脂质中DHA的含量变化

图3 藻油水解的反应动力学曲线

图4 甘三酯中DHA含量测定及回收率计算

该酶解反应底物TAG转化为DAG、MAG和FFA三类产物，根据表1计算了回收率，考察了底物的水解量和产物的生成量随时间的变化，如图3所示。随着酶解反应的进行，TAG的含量不断下降，产物DAG、MAG与FFA的总含量逐渐升高。当酶解时间为12 h时，反应趋于平衡，表明TAG不再向DAG、MAG和FFA转化。进一步测定了不同反应时刻酶解产物中TAG内DHA的含量并计算了回收率，结果如图4所示。反应前，底物中TAG内DHA含量仅为35.1%，随着反应的进行，DHA含量不断升高，当酶解时间为12 h时，DHA的质量分数为55.4%，浓缩了1.58倍，回收率高达68.2%。但是，反应12 h之后，TAG中DHA的含量和回收率均呈现下降趋势。因此，控制AO脂肪酶催化藻油的反应时间，当反应达到平衡时，DHA可以被富集在甘油三酯中。

2.3 产物中甘油三酯脂肪酸组成及含量分析

采用气相色谱法进一步测定了酶解产物中TAG脂肪酸含量及组成，结果如表2与图5所示。

由表2可知，酶解产物中TAG除了含有目标物DHA以外，还含有三种饱和脂肪酸(Saturated Fatty Acids, SFAs)，分别为十五酸、棕榈酸、十七烷酸，一种单不饱和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acids, MUFAs)油酸以及其他四种不饱和脂肪酸，分别为亚油酸、α-亚麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳五烯酸。

由图5可知，随着酶解反应的进行，TAG中DHA含量显著升高，而SFAs的含量则不断降低，其他不饱和脂肪酸含量则基本不变。反应至12小时，产物TAG中的DHA含量达到最大值，继续反应甘油骨架上的DHA将被缓慢水解。在酶解过程中，大分子多不饱和脂肪酸DHA不易被脂肪酸酶AO水解，更倾向于留在TAG甘油骨架上，而其他的小分子脂肪酸则更易被水解，从而造成了DHA在产物TAG中被富集。图6为二十二碳六烯酸甘三酯化学结构示意图，由图6可知，长碳链的DHA易对酯键形成包裹效应，形成较大的空间位阻，导致酶的活性中心不易靠近酯键，极大降低了该类型酯键的水解反应的速率。

表2 酶解产物甘三酯中的脂肪酸组成分析

图5 酶解过程中产物甘油三酯各脂肪酸含量的变化

图6 二十二碳六烯酸甘三酯化学结构式

2.4 核磁共振分析TAG甘油骨架上脂肪酸分布

为了进一步探究酶解过程中DHA相比于其他脂肪酸倾向于保留在TAG甘油骨架上的原因，采用13C NMR考察了酶解产物TAG上的DHA及其他脂肪酸在甘油骨架不同位点上的含量分布，如图7所示。Ⅰ-Ⅴ区域分别是脂肪酸羰基碳、脂肪酸烯烃碳、氘代氯仿的碳原子、甘油骨架内部碳以及甘油骨架上羰基相连的亚甲基和脂肪酸末端甲基碳原子。对不同酶解反应时刻的产物中TAG的脂肪酸羰基区域(Ⅰ区域)进行比较分析，由图7可知，TAG甘油骨架sn-1(3)位上SFAs含量随着酶解反应的进行不断下降，DHA含量则逐渐升高；而甘油骨架sn-2位上主要是DHA，其含量在反应过程中保持不变；甘油骨架sn-1(3)和sn-2位上MUFAs由于占比过低，变化难以观测。当反应12 h后，虽然甘油骨架sn-1(3)位上SFAs已完全水解，但sn-1(3)和sn-2位上的DHA含量也开始下降，说明酶解反应时间过长也会导致甘油骨架上的DHA缓慢水解。

图7 13C-NMR分析酶解产物中TAG甘油骨架上的脂肪酸分布

3 结论

脂肪酶法富集不饱和脂肪酸工艺往往具有条件温和、成本低廉等优势，但最终形成实用高效的生产工艺必须对酶催化反应原理进行深入的了解。本研究表明AO脂肪酶在水解法裂殖壶藻油脂过程中，DHA主要富集在产物甘三酯中，反应12 h后，DHA质量分数为55.43%，浓缩了1.58倍。经气相色谱结合核磁共振碳谱(13C-NMR)分析，在AO脂肪酶催化反应过程中，甘三酯甘油骨架上的DHA由于位阻效应而不易被水解，即酶对不同种类脂肪酸的水解具有选择性，结合后继分子蒸馏、柱层析等方法对甘三脂进行分离，有望开发形成一整套高效经济的DHA浓缩工艺。