有氧运动对APOE-/-小鼠脂肪组织脂代谢的影响

王军力，燕小妮

(怀化学院体育与健康学院，湖南 怀化 418000)

脂肪分布不同，产生心血管疾病的危险因子也不同[1]。与皮下脂肪组织 (Subcutaneous adipose tissue,SAT)相比，内脏脂肪组织(Visceral adipose tissue,VAT)更易引起各种代谢性疾病[2]。基因阵列研究也发现，肥胖人群VAT和SAT基因表达不同，与SAT相比，VAT产生了更多与心血管疾病和代谢紊乱有关的因素[3]。心外膜脂肪组织(Epicardial adipose tissue,EAT)胚胎学起源于VAT[4]，其厚度与VAT的厚度密切相关[5]，可能在与肥胖相关的心血管疾病的发生和发展中扮演着与VAT相似或者相同的作用。Thomas等研究表明有氧运动对VAT的体积的减少不依赖于SAT体积的减少[6]，而Kim等研究发现有氧运动对EAT厚度的降低伴随着VAT厚度的减少[7]。这些研究表明在组织水平上，VAT与EAT对有氧运动具有相似的生物学适应，而SAT对有氧运动具有不同的生物学适应。但是关于VAT、EAT在蛋白水平对有氧运动是否也存在相似的生物学适应，以及与SAT是否不同的问题，目前尚缺少充分的实验依据。

APOE-/-小鼠能对富含胆固醇的脂蛋白清除障碍，食用普通饲料即可自发形成动脉粥样硬化病变[8]，且与人类动脉粥样硬化的特征非常相似，因此成为研究动脉粥样硬化的有效模型。高血压、糖尿病、血脂异常以及全身炎症等都是加速动脉粥样硬化形成的机制[9]，而脂肪组织中过多的脂肪积聚会导致氧化应激水平提高，随后造成脂肪因子异常分泌，这被认为是对血管壁产生不利影响。造成动脉粥样硬化最为重要的机制[10，11]。目前，已有大量研究证实有氧运动是改善动脉粥样硬化的有效方法，但这些研究主要集中在有氧运动对血管内皮功能、内皮源性细胞动员、血管及血清的炎性和氧化应激、血浆脂质的影响研究上[12]。目前还尚未有研究从有氧运动对动脉粥样硬化病变的人或动物不同脂肪组织的脂代谢、氧化应激和炎性三种生理状态关系层面，探讨有氧运动对动脉粥样硬化的有益影响。

因此，本研究试图通过调查12wk有氧运动干预对SAT、VAT和EAT三种脂肪组织中与脂代谢[脂肪酸结合蛋白4(Fatty acid binding protein-4，FABP4)和脂滴包被蛋白(perilipin)]、氧化应激[谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxi dase，GSH-Px)、铜锌超氧化物歧化酶(Copper/Zinc- superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)]和炎性[脂联素(adiponectin)、血管内皮生长因子ɑ(Vascular endothelial growth factor-ɑ，VEGFɑ)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)]相关的9种代表性蛋白表达的情况，一是观察有氧运动对APOE-/-小鼠不同脂肪组织脂代谢、氧化应激和炎性状态的影响，二是从蛋白水平探索APOE-/-小鼠不同脂肪组织三类蛋白对有氧运动的适应性特征，并从脂代谢、氧化应激和炎性三种生理状态的关系层面，探讨有氧运动对动脉粥样硬化的有益影响。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物及分组

7周龄SPF级雄性APOE-/-小鼠，购自广东省医学实验动物中心，许可证号为SCXK(粤)2008-0002，经过一周适应性的喂养后[动物房温度为(25±1)℃，湿度为50%±5%，光照周期为12h]，随机分为安静组(AC组)和运动组(AE组)，每组各8只动物。APOE-/-小鼠喂养高脂饲料，高脂饲料配方为0.15 %(质量比)的胆固醇、21%(质量比)的脂肪和78.85%(质量比)的基础饲料。

1.2 运动方案

APOE-/-小鼠采用不负重的游泳训练模式，该模式在白色的大水桶中进行(无水流)，每桶4只动物，水深60 cm，水温32±1℃。APOE-/-小鼠进行12wk的有氧运动，第1wk30min/d，第2-12wk 60 min/d，每周训练6 d，第7 d休息。每天游泳训练安排在下午5点至6点。

1.3 实验取材

干预停止36 h后(避免急性运动效应)，利用10 %水合氯醛(3.5 ml/kg bw)对小鼠进行麻醉后，分别取腹部皮下脂肪组织(SAT)、肾周脂肪组织(VAT)和心外膜脂肪组织(EAT)置于液氮罐中备用。

1.4 主要实验仪器、试剂及材料

1.4.1 主要实验仪器

Ultra Pure UF纯水系统(上海和泰仪器有限公司)；YXQ-LS-30SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；WO-9413B型凝胶成像系统(北京六一仪器厂)；DYCZ-24DN型电泳仪(北京六一仪器厂)；DYCZ-40D型电泳仪(转膜，北京六一仪器厂)；AX-ⅡX射线摄影暗(广东粤华医疗器械厂有限公司)。

1.4.2 主要实验试剂及材料

PVDF膜(Milli pore)；GADPH酶标记二抗 (武汉博士德)；兔抗大鼠FABP4(北京博奥森)、perilipin(北京博奥森)、GSH-Px(武汉博士德)、Cu/Zn-SOD(武汉博士德)、Mn-SOD(武汉博士德)、adiponectin(北京博奥森)、VEGFα (武汉博士德)、IL-6 (武汉博士德)和TNF-α (武汉博士德)多克隆抗体。

1.5 检测指标及方法

脂肪组织FABP4、perilipin 、GSH-Px、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、adiponectin、VEGFα、TNF-α和IL-6蛋白表达均采用Western-blot方法检测。Western-blot检测步骤为：(1)取20 μL的组织裂解液，并加5 μL 5×电泳上样缓冲液(预染Maker取5 μL)；(2)沸水浴5 min，12 000 g/min离心3 min，去除不溶性蛋白，上样(BCA法总蛋白定量，上样量为100 μg总蛋白/个样品)；(3)SDS-PAGE电泳(5 %浓缩胶90V，12 %分离胶110 V，不恒定电流，约1.5 h)；(4)取分离胶将其放入电转膜仪转膜(90 V，30-90 min)，将蛋白转移到PVDF膜上，室温下用5 %脱脂奶粉(用TBS稀释)室温封闭30 min，再4 ℃过夜，第二天室温平衡。不洗膜加一抗(1∶200，稀释液含2 %的脱脂奶粉)孵育，4 ℃过夜。TBS洗膜四次，第一次15 min，后三次每次5 min。将膜在室温下与二抗(1∶5 000，稀释液含2 %的脱脂奶粉)室温下孵育1 h，TBS漂洗；(5)将PVDF膜上的TBS吸干，加入ECL化学发光试剂(试剂盒)，放入凝胶成像系统;(6)采用WO-9413B型凝胶成像系统自带软件Gelpro32来分析胶片中的蛋白条带中的灰度值。

1.6 数据统计

应用SPSS17.0对各组数据进行分析，描述性统计采用平均数±标准差(QUOTE±s)表示，不同组别数据的差异性采用单因素方差分析，p<0.05为显著性差异，p<0.01为非常显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同组别APOE-/-小鼠脂肪组织脂代谢相关蛋白表达的分析

AC组APOE-/-小鼠VAT、EAT的FABP4的表达明显低于SAT的FABP4的表达(P<0.05)，12wk有氧运动明显增加了VAT、EAT的FABP4表达(P<0.01)，SAT的FABP4表达无明显变化(P>0.05)(见图1)；AC组APOE-/-小鼠VAT、EAT的perilipin的表达明显高于SAT的perilipin的表达(P<0.05,P<0.01)，12wk有氧运动明显降低了APOE-/-小鼠VAT的perilipin表达(P<0.01)，EAT的perilipin表达有降低的趋势，但无统计学意义(P>0.05)，对SAT的perilipin表达没有明显影响(P>0.05)(见图2)。*表示P<0.05，**表示P<0.01，与AC组SAT相应蛋白比较；#表示P<0.05，##表示P<0.01，与AC组同一脂肪组织相应蛋白比较(下同)。

图1 不同组别FABP4表达变化(n=8)

图2 不同组别perilipin表达变化(n=8)

2.2 不同组别APOE-/-小鼠脂肪组织氧化应激相关蛋白表达的分析

AC组APOE-/-小鼠VAT、EAT的GSH-Px表达明显低于SAT的GSH-Px的表达(P<0.01)，SAT、VAT和EAT的Cu/Zn-SOD和Mn-SOD蛋白表达无明显不同(P>0.05)(见图3、图4和图5)；12wk有氧运动明显增加了APOE-/-小鼠VAT、EAT的GSH-Px的表达水平(P<0.01)，对SAT的GSH-Px表达没有明显影响(P>0.05)(见图3)；12wk有氧运动对APOE-/-小鼠三种脂肪组织的Cu/Zn-SOD表达没有明显影响(P>0.05)(见图4)；12wk有氧运动明显增加了APOE-/-小鼠VAT、EAT的Mn-SOD表达(P<0.05)，对SAT的Mn-SOD表达没有明显影响(P>0.05)(见图5)。

图3 不同组别小鼠GSH-Px表达变化(n=8)

图4 不同组别Cu/Zn-SOD表达变化(n=8)

图5 不同组别Mn-SOD表达变化(n=8)

2.3 不同组别APOE-/-小鼠脂肪组织炎性相关蛋白表达的分析

AC组APOE-/-小鼠VAT、EAT的VEGFα、TNF-α和IL-6的表达都明显高于SAT的三种蛋白的表达(P<0.05,P<0.01)(见图6、图7、图8和图9)，而adiponectin的表达无明显不同(P>0.05)(见图6)；12wk有氧运动明显增加了APOE-/-小鼠VAT的adiponectin表达(P<0.01)，EAT的adiponectin表达有增加的趋势(P>0.05)，SAT的adiponectin表达有降低的趋势(P>0.05)(见图6)；12wk有氧运动明显增加了APOE-/-小鼠SAT的VEGFα的表达(P<0.01)，对VAT、EAT的VEGFα的表达没有明显影响(P>0.05)(见图7)；12wk有氧运动明显降低了APOE-/-小鼠VAT、EAT的TNFα的表达(P<0.01)，对SAT的TNF-α的表达没有明显影响(P>0.05)(见图8)；12wk有氧运动明显降低了APOE-/-小鼠SAT，VAT和EAT的IL-6表达(P<0.01)(见图9)。

图6 不同组别adiponectin表达变化(n=8)

图7 不同组别VEGFα表达变化(n=8)

图8 不同组别TNF-α表达变化(n=8)

图9 不同组别IL-6表达变化(n=8)

3 讨论

3.1 有氧运动对不同脂肪组织脂代谢蛋白表达的影响

FABP4在脂肪细胞中高度表达[13]，FABP4缺乏的脂肪细胞，脂解效率降低[14]。本研究发现12wk有氧运动明显增加了APOE-/-小鼠VAT、EAT的FABP4的表达，但对SAT的FABP4表达无明显影响。因此，本研究认为12wk有氧运动可能增强了APOE-/-小鼠VAT、EAT脂解能力，减少了VAT、EAT脂肪的积聚。perilipin具有调节脂解作用[15]。本研究发现12wk有氧运动明显降低了APOE-/-小鼠VAT的perilipin的表达，EAT的perilipin表达有降低的趋势。而SAT的perilipin表达没有明显影响。尽管尚未有直接证据显示perilipin水平降低对脂代谢的影响，但是Beylot等[16]研究显示perilipin缺乏鼠，致使基础状态下脂肪的氧化适度增加。因此，本研究认为12wk有氧运动导致VAT的perilipin表达降低(EAT具有降低的趋势)，可能增加了VAT脂肪氧化，减少了VAT的积聚。同时，本研究发现AC组APOE-/-小鼠VAT、EAT的FABP4显著低于SAT的FABP4，而VAT、EAT的perilipin显著高于SAT的perilipin，提示APOE-/-小鼠VAT、EAT较SAT可能更易导致脂肪的积聚。本研究表明12wk有氧运动导致APOE-/-小鼠VAT、EAT两种与脂代谢相关的蛋白FABP4和perilipin产生了相似的生物学适应(并不完全一致)，而SAT的两种蛋白并没有发生明显变化。

3.2 有氧运动对不同脂肪组织氧化应激蛋白表达的影响

本研究发现AC组APOE-/-小鼠的VAT、EAT中的GSH-Px含量明显低于SAT，而Mn-SOD与Cu/Zn-SOD三种脂肪组织含量没有明显不同，提示VAT、EAT的抗氧化能力低于SAT。这可能是由于VAT、EAT处于更严重的氧化应激状态，导致抗氧化酶过度消耗所致。Capel等人的研究与本研究相似，他们发现肥胖鼠肝脏维生素A(具有抗氧化作用)的浓度明显低于不肥胖鼠，并且指出长期处于肥胖状态(脂肪积聚)的小鼠抗氧化酶被过度消耗，是导致抗氧化酶浓度或活性下降的原因[17]。有研究显示，长期规律的有氧运动通过增加GSH-Px和Mn-SOD的表达提升内源性的抗氧化能力[18]。本研究发现12wk有氧运动导致APOE-/-小鼠VAT、EAT中的GSH-Px和Mn-SOD蛋白表达明显增加，这与前人的研究结果相似，但Cu/Zn-SOD的表达没有明显变化。12wk有氧运动对APOE-/-小鼠SAT的三种脂肪组织抗氧化酶的表达没有明显影响。本研究提示12wk有氧运动明显提升了APOE-/-小鼠VAT、EAT的抗氧化能力，对SAT抗氧化能力没有明显影响。同时VAT、EAT的抗氧化酶表现出对有氧运动相同的生物学适应，二者与SAT的抗氧化酶对有氧运动的生物学适应不同(除了Cu/Zn-SOD，三种脂肪组织都未发生变化)。

3.3 有氧运动对不同脂肪组织焱性蛋白表达的影响

adiponectin是脂肪细胞分泌的一种抗炎性[19]、抗动脉粥样硬化[20]作用的细胞因子，能够抑制TNF-α和IL-6的产生[21]，同时adiponectin能够刺激抗焱性细胞因子(例如IL-10和IL-1β)的合成[22]。增加体力活动量能够增加adiponectin的水平[23]。本研究发现12wk有氧运动明显增加了APOE-/-小鼠VAT的adiponectin的表达，EAT的adiponectin有增加的趋势，而SAT的 adiponectin表达有降低的趋势。本研究表明12wk有氧运动能够增加APOE-/-小鼠的抗炎性、抗动脉粥样硬化的作用(VAT的adiponectin表达增加所致)。TNF-α[24]和IL-6[25]是研究较多的促炎性细胞因子，在脂肪细胞中被大量表达。本研究发现AC组APOE-/-小鼠VAT和EAT的IL-6和TNF-α表达明显高于SAT，说明VAT、EAT的炎性程度明显高于SAT，这与Cawthorn等的研究结果一致，他们的研究也发现VAT的炎性程度明显高于SAT[24]。12wk有氧运动明显降低了三种脂肪组织IL-6的表达，TNF-α仅在VAT、EAT明显降低。这表明有氧运动对脂肪组织、特别是对VAT、EAT具有明显的抗炎性作用。12wk有氧运动导致APOE-/-小鼠VAT的抗炎性因子adiponectin表达增加(EAT趋势增加)，这可能是IL-6和TNF-α含量减少的原因之一。另外，研究显示FABP4具有促进血管新生的作用[26]，上述提到本研究发现12wk有氧运动明显增加了APOE-/-小鼠VAT、EAT的FABP4水平，这可能会导致VAT、EAT血流量增加，提高了对炎性因子的氧化作用，是VAT、EAT的IL-6和TNF-α含量下降的又一原因。VEGFα，是一种促炎性细胞因子[27]，能够促进白色脂肪组织中血管再生[24]。本研究发现AC组APOE-/-小鼠VAT、EAT的VEGFα的水平明显高于SAT，12wk有氧运动明显增加了SAT的VEGFα蛋白的水平，VAT、EAT的VEGFα表达没有明显变化。12wk有氧运动导致SAT的IL-6和VEGFα发生相反变化的原因尚不明确，可能原因是VEGFα(促进血管再生)水平升高，导致SAT血流量增加，提高了SAT的氧化作用，从而导致IL-6的水平降低。12wk有氧运动导致APOE-/-小鼠VAT、EAT四种与炎性相关的因子产生较为相似的生物学适应(并不完全一致)，而SAT中除了IL-6表现出与VAT、EAT一致的生物学适应外，其他三种因子的生物学适应并不相同。

3.4 有氧运动从脂肪组织脂代谢、氧化应激和炎性关系层面对动脉粥样硬化的有益影响的探讨

本研究发现APOE-/-小鼠VAT、EAT较SAT更易导致脂肪的积聚(VAT、EAT的FABP4明显低于SAT，而perilipin明显高于SAT)，从而造成VAT、EAT处于更严重的氧化应激状态(GSH-Px表达明显低于SAT)，随之产生的促炎性细胞因子TNF-α和IL-6明显增多(释放入血液)，增加对血管壁的不利影响。因此，本研究认为VAT和EAT的积聚可能是动脉粥样硬化发生的重要诱因之一。12wk有氧运动明显增加了VAT、EAT的FABP4的表达，降低了VAT的perilipin表达(EAT有降低的趋势)，提示有氧运动干预可能减少VAT、EAT脂肪的积聚，从而改善了VAT、EAT的氧化应激状态，导致VAT产生的adiponectin增加(EAT趋势增加)，随后VAT、EAT产生的TNF-α和IL-6明显减少(改变脂肪细胞炎性因子的异常生成)，减少了对血管壁的不利影响，对动脉粥样硬化产生了有益影响。但是，有氧运动也可能直接通过提高VAT、EAT(本研究发现有氧运动导致GSH-Px和Mn-SOD表达明显提高)的抗氧化能力，降低脂肪组织的氧化应激水平，改善脂肪细胞炎性因子的异常生成，对动脉粥样硬化产生有益影响。当然，本研究也并不能排除有氧运动对脂肪细胞炎性因子本身能够产生有益影响。肥胖(脂肪积聚)、动脉粥样硬化和有氧运动的确切关系机制，还需要通过进一步的实验加以研究。

4 本研究的不足之处

第一，尽管本研究表明12wk有氧运动干预能够增加APOE-/-小鼠VAT、EAT的FABP4的表达，降低VAT、EAT的perilipin表达，可能导致脂解作用加强，但由于本研究没有称量AC组和AE组APOE-/-小鼠心外膜和肾周脂肪组织的质量，不能为有氧运动干预减少VAT、EAT的积聚提供直接的证据。第二，由于本研究所检测的三种脂肪组织中脂代谢、氧化应激和炎性蛋白的数量较少(仅为9种)，对于VAT、EAT中其它蛋白或者因子是否对有氧运动产生一致或者相似的生物学适应的问题，则需要进一步研究。

5 小结

本研究首次从蛋白水平观察了有氧运动对动脉粥样硬化模型APOE-/-小鼠三种脂肪组织中脂代谢、氧化应激和炎性蛋白适应性表达的影响，并从脂肪组织脂代谢、氧化应激和炎性三种生理状态关系层面这一新的角度，探讨了有氧运动对动脉粥样硬化的有益影响。本研究的主要发现有四点：(1)12wk有氧运动可能通过增加FABP4的表达和/或降低perilipin表达，减少VAT、EAT脂肪积聚；(2)12wk有氧运动有效的改善了APOE-/-小鼠VAT、EAT的氧化应激和炎性状态，对SAT影响不明显(除IL-6降低，VEGFα升高)；(3)12wk有氧运动导致APOE-/-小鼠VAT、EAT脂代谢、氧化应激和炎性相关蛋白表现出较为相似(并不完全一致)的生物学适应；而SAT表现的绝大部分的生物学适应与前二者不同(除IL-6，Cu/Zn-SOD)；(4)12wk有氧运动可能通过减少VAT、EAT的脂肪积聚，改善氧化应激状态，改变脂肪细胞炎性因子的异常生成从而对动脉粥样硬化产生有益影响。当前研究既为肥胖(脂肪积聚)、动脉粥样硬化和有氧运动的关系研究提供一定的实验基础和新的研究思路，也验证了有规律的有氧运动或者体力活动是一种有效的抗动脉粥样硬化的行为，应该在人们的生活中得到重视。