基于网络药理学和分子对接技术的白芍治疗抑郁症作用机制探讨△

张景霞，赵重博，李凡，李雅娟，王卫锋，李莎莎，李芳*

1.陕西中医药大学 药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003

抑郁症是最常见的精神疾病，患者表现为心情持久低落、悲观，多伴有睡眠障碍、身体不适、思维迟缓等，痴呆患病率高，神经心理学测试受损较大，严重会产生自杀想法[1]。近年来，抑郁症的发病率逐年上升，其发病机制尚不明确[2]。中医主治抑郁症多为疏肝理气、解郁[3]。白芍为毛茛科植物，有养血敛阴、平抑肝阳、柔肝止痛的作用，现代药理作用有抗炎、抗氧化、抗抑郁[4]等，在临床常配伍使用。研究表明，白芍中的有效成分具有明显的抗抑郁作用[5-12]，但其机制需要进一步阐明。多成分、多靶点、多通路是中医药治疗疾病的特点，因此，本研究运用网络药理学和分子对接手段[13]，探讨白芍治疗抑郁症可能的靶点和作用机制，为中医药治疗抑郁症的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 潜在活性成分及靶点筛选

通过中药系统药理学与分析平台（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）检索“白芍”，得到白芍的化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为筛选条件[3,14]，得到白芍主要化学成分及相关靶点，并通过UniProt数据库（http//www.uniprot.org/）规范名称。

1.2 抑郁症靶点的获取

在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）和DisGeNET 数据库（https://www.disgenet.org/）检索“depression”，物种设定为人类，得到抑郁症相关靶点。

1.3 白芍靶点与疾病靶点韦恩（Venn）分析

将白芍主要化学成分的作用靶点与抑郁症疾病靶点数据集进行Venn 分析，得到白芍活性成分与抑郁症的靶向关系。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

将得到的交集靶点导入STRING 数据库，物种设为“Homosapiens”，中等置信度（medium confidence）设为0.4，其余参数为默认值，构建PPI网络图，利用“Networkanalysis”功能进行网络的拓扑属性分析，根据其节点度（degree）值明确靶点间作用关系。

1.5 生物过程注释及代谢通路分析

通过R Studio 软件进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）富集分析。GO富集分析描述了基因靶点的分子功能（MF）、细胞组成（CC）和参与的生物过程（BP），将MF、CC和BP均设Pvalue Cutoff为0.05；用KEGG 数据库富集靶点基因参与的主要代谢途径，通路富集分析设定Pvalue Cutoff为0.05。

1.6 分子对接

在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的3D 结构；从RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）数据库中筛选得到核心靶蛋白的晶体结构，去除水分子和配体小分子，分离出潜在蛋白的结构。在Discovery Studio 2016软件中采用LibDock 程序对接，根据化合物及蛋白质分子设定对接空腔和大小，其余参数保持默认值进行分子对接。

2 结果与分析

2.1 有效成分的获取与筛选

通过TCMSP 数据库获取白芍中85 个化学成分。根据OB≥30%、DL≥0.18 筛选得到有效成分13 个，再根据抑郁症的潜在靶点和白芍相关靶点的交集映射反推白芍可能具有治疗作用的有效成分共8 个，化合物信息见表1。

表1 白芍治疗抑郁症的有效成分

2.2 疾病及药物靶点筛选

通过GeneCards 和DisGeNET 数据库检索得到抑郁症相关靶点共9785个，与77个白芍潜在靶点进行匹配，通过Venny 2.1.0 映射最终得到交集靶点67个（图1）。

图1 白芍成分靶点及抑郁症疾病靶点韦恩图

2.3 PPI网络建立

将67 个交集基因名导入SRTING 数据库，下载TSV 文本导入Cytoscape 3.7.2 软件，得到PPI 网络图（图2），共67 个节点、422 条边，蛋白激酶B1（Akt1）和白细胞介素-6（IL-6）与其他靶点联系最多，度值最高，处于核心地位，其次是丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、转录因子AP-1（JUN）和肿瘤坏死因子（TNF）等。

图2 白芍治疗抑郁症关键靶点的PPI网络

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

GO 富集分析结果表明，白芍治疗抑郁症67 个关键靶点主要集中在BP 上，共2825 条富集结果，其中对脂多糖的反应、细菌源分子的反应和对抗生素的反应参与的基因数目最多；CC 中有189 条富集结果，其中靶点参与最多的是膜筏、膜区和突触后膜；MF 中有71 条富集结果，其中神经递质受体所占比重较大，其与神经递质结合并传递信号，改变细胞活动；还涉及铵离子结合、突触后神经递质受体活动和G 蛋白偶联神经递质受体活动等过程。推测白芍可能通过调节机体以上多种生物过程而发挥抗抑郁作用。排名前10位的GO分析结果见图3。

图3 白芍治疗抑郁症活性靶点GO富集分析

对67 个靶点进行KEGG 通路富集分析，共得到209 条富集结果，筛选P<0.05，排名前20 的通路G为候选信号通路，主要涉及糖基化终末产物及其受体（AGE-RAGE）信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路、TNF信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信号通路等，推测白芍可能通过作用于多种疾病通路、信号通路发挥抗抑郁作用（图4）。

图4 白芍治疗抑郁症活性靶点KEGG通路富集分析

2.5 药物-成分-靶点-通路网络

利用Cytoscape 3.7.2 中的Merge 功能将药物-成分、成分-靶点、靶点-通路网络合并，得到药物-成分-靶点-通路网络，见图5。根据网络图分析得知，通路AGE-RAGE 和神经活性配体-受体相互作用与潜在靶点存在较多的连接（表2）。度值排名前5 位的化合物为山柰酚、β-谷甾醇、儿茶酚、芍药苷和谷甾醇，分别能与44、30、6、3、2 个靶点蛋白发生作用。芍药二酮、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、丁字香萜均作用于靶点PGR。

表2 白芍治疗抑郁症的代谢通路与靶点

图5 白芍治疗抑郁症的药物-成分-靶点-通路网络

2.6 分子对接分析

根据药材-成分-靶点-通路网络选取活性成分连接靶点数较多的成分，β-谷甾醇、丁子香萜、谷甾醇、芍药二酮和山柰酚均作用于靶点PGR，利用Discovery Studio 2016 软件进行对接验证，见表3、图6。丁字香萜能够与PGR 中ALA211、PRO210、PHE241、TYR63等氨基酸残基结合，产生氢键和共轭效应，增加了结构的稳定性，配体受体结合得分较高；β-谷甾醇能够与LYS58、TYR63、PHE241 等位点结合形成大量的氢键，亲和力较好；谷甾醇与TYR63、PRO235、TYR26等位点结合；芍药二酮与PRO235、TYR27、TYR26等位点结合。表明各活性成分与靶点PGR 具有良好的亲和力，这与药物-成分-靶点-通路网络分析结果一致。

图6 白芍中化合物与治疗抑郁症的潜在靶点分子对接

表3 白芍中化合物与治疗抑郁症的潜在靶点分子对接结果

3 讨论

本研究通过网络药理学方法筛选了白芍的8 个活性成分，预测67 个治疗抑郁症的潜在靶点。根据药物-成分-靶点-通路网络度值排名推测化合物谷甾醇、山柰酚及靶点转录因子p65（RELA）、Akt1、TNF、MAPK8、半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）、JUN和IL-6 可能是白芍配伍治疗抑郁症的关键化合物和靶点；PPI 网络拓扑学分析结果表明，IL-6 和Akt1与其他靶点的连接最多，IL-6 可诱导淋巴细胞产生免疫球蛋白，作用于B 细胞、T 细胞、肝细胞和中枢神经系统细胞[15]，主要功能是参与炎症反应及造血过程、刺激活化B 细胞增殖等[16]。研究证实，抑郁障碍患者前额皮质区IL-6 mRNA 和蛋白表达水平升高[17]；Akt1 是一种下游酶，通过调节其下游效应物糖原合成酶激酶-3（GSK-3）来促进生长因子介导的细胞存活和阻止细胞凋亡死亡[18]，研究表明，Akt1 合成的GSK-3 具有抗抑郁作用[18-19]。GO 富集结果显示，白芍发挥抗抑郁作用的生物过程为参与调节膜电位、铵离子、G 蛋白偶联受体信号途径及调节胞浆钙离子浓度等。KEGG 富集结果显示，在AGE-RAGE 信号通路、PI3K-Akt和TNF 信号通路上集中着白芍抗抑郁较多的靶点。选取成分β-谷甾醇、丁子香萜、谷甾醇、芍药二酮和山柰酚与靶点PGR分子对接，结果表明，PGR 与这些化合物有较好对接活性。

临床研究表明，抗抑郁剂可通过上调5-羟色胺（5-HT）、脑源性神经营养因子（BDNF）的水平以促进海马神经元新生[20]，增加海马齿状回前体细胞数量来发挥抗抑郁作用[21]。白芍可使海马组织中单胺类神经递质去甲肾上腺素（NE）和5-HT 的水平明显升高，并且使5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）的水平明显降低，达到抗抑郁的作用[22]。β-谷甾醇能显著增加脑内5-HT、NE 和代谢产物5-HIAA 水平，有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、解热、免疫调节、止痛的作用，且其与潜在靶点高度联系[23]。β-谷甾醇的抗抑郁活性是由5-HT、NE 和代谢产物5-HIAA 等神经递质介导的[24]；山柰酚是一类黄酮醇类化合物，具有较强的抗炎、抗糖尿病、抗癌及神经保护等作用，研究表明，其能通过抗炎、抗氧化及降低海马神经元的凋亡率来减轻抑郁症模型大鼠海马体的损伤。从靶点角度来看，RELA、Akt1、TNF、MAPK8、CASP3、JUN 度值连接次数均在15 次以上，推测其为抗抑郁治疗的关键靶点。MAPK8参与细胞各种过程，如增殖、分化、迁移及程序性细胞死亡，且已被证实在行为、学习和记忆等方面起到关键调节作用[25]；Akt1 通过调节其下游效应物糖原合成GSK-3达到抗抑郁的作用[18-19]。综上，推测白芍通过多成分、多靶点协同发挥抗抑郁作用。

神经活性配体-受体相互作用信号通路能通过改进神经递质的传导功能发挥抗抑郁作用[26]，为质膜上通路的受体及配体[27]；小鼠前额叶灰质和海马内的基因表达差异主要集中在该通路上[28]。PI3K-Akt信号通路是BDNF/酪氨酸激酶受体B（TrkB）的下游信号通路，被认为是治疗抑郁症的重要信号通路[29]，Akt 为重要枢纽，能够促进核转录因子-κB（NF-κB）蛋白表达，使炎症反应失调而加重抑郁症状[30]；研究表明，抑郁与促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）及抗炎因子（IL-2、IL-4）的免疫激活及分泌之间存在因果关系[31]；综上，推测白芍通过多种疾病多条通路发挥抗抑郁作用。

本研究预测了白芍治疗抑郁症的可行性，进一步明确了其多成分、多靶点、多途径治疗的特点，但关键生物过程和关键途径的调控仍需深入研究，后续应通过体外细胞实验和体内动物实验等验证，确保预测结果的科学性和正确性。