巨大芽孢杆菌对商洛烤烟生长及土壤微生物的影响

陈月星，黄金辉，刘翠霞，闫超超，张永锋，李立丹

(1.商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000；2.陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院，陕西商洛 726000；3.商洛市烟草公司洛南分公司，陕西商洛 726000；4.陕西省烟草公司 商洛市公司，陕西商洛 726000)

中国是一个烟草大国，烟草产业在中国国民经济中占有重要的地位，烟叶和卷烟产量均居世界首位，烟草种植面积为13 300 km2，年产量为 450万～500万t[1]。烟草栽培过程中，由于长期连作和化肥的连年使用，导致植烟土壤结构变差[2-3]、肥料利用率降低、肥力下降、土壤微生物多样性减少[4-5]、病虫害加重等生产和生态问题，严重制约着烟叶质量风格的形成和可持续健康发展。而改良土壤、培肥地力，构建以“土壤-微生物-根系”为核心的高效健康的烟田微生态系统是解决这一问题的途径之一。

前人研究结果表明，施用微生物菌剂可促进土壤养分吸收，提高烟叶品质[6-9]，降低烟草病虫害发生率[10-11]，能够改善土壤环境、实现土壤保育[12-15]，有利于烟区的健康和可持续发展，具有十分重要的生产、生态和经济效益。基于此，本文通过田间试验研究巨大芽孢杆菌菌剂对秦岭商洛地区烤烟的生长及土壤微生物的影响，以期通过微生物菌剂的施用改善烤烟根际微生态环境，促进烤烟生长，提高烟叶产质量。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

商洛地处秦岭腹地，位于亚热带向暖温带过渡地带，气候温和，山青水秀，林丰矿富。该区域光照资源丰富，日照时数为2 133.8 h，春夏日照时数最多，年均气温12.9 ℃，7月间气温最高 25 ℃左右，≥10 ℃的积温为4 142.7 ℃，年降雨量800～900 mm，多集中在6至9月份，占全年降水量的50%以上。试验田位于陕西省商洛市洛南县柏峪寺镇薛楼村(34°10′2″N，110°20′5″E)，土壤基本理化性质为：pH 5.47，有机质8.60 g/kg，速效磷27.75 mg/kg，速效钾 152.25 mg/kg。

1.2 供试材料

烤烟品种：‘云烟99’。

菌剂：巨大芽孢杆菌购于北京航天恒丰科技股份有限公司，活菌含量为1×109CFU/g。

1.3 试验设置

按巨大芽孢杆菌施用量，试验设置6个处理：对照CK(不施用菌剂)、A1(2 kg/667m2)、A2(6 kg/667m2)、A3(10 kg/667m2)、A4(14 kg/667m2)、A5(16 kg/667m2)，移栽时与定根水混溶施于烟株根部，每个处理重复3次，共18个小区，每个小区4行，每行包含15株烤烟，每个小区共计60株，小区面积3.6 m×8.4 m，试验小区四周设置保护行(左右各2行，前后各3株烟)，各处理除微生物菌剂的施用外，其他操作与对照(CK)保持一致，均按本年度当地常规操作要求执行。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 烟株农艺性状观测 各处理分别选取有代表性的烟株10株，于打顶后测定烟株的株高、茎围、节距、单株有效叶片数、腰叶长和宽。

1.4.2 主要经济性状分析 各处理单独采烤，进行烤后烟叶外观质量鉴定，根据烤烟42级国家标准对烤后烟叶进行分级，统计各处理烟叶的产量、产值、均价及上中等烟比例等经济性状。

1.4.3 土壤微生物群落特征分析 分别于移栽后30 d(团棵期)、移栽后60 d(旺长期)和移栽后90 d(成熟期)采集土样，每个处理选取长势一致的烟株3株，采用抖根法，收集抖落的根际土壤，混合后用无菌袋保存。

本研究应用土壤小量DNA提取试剂盒(OMEGA，USA)提取土壤微生物总DNA，采用琼脂糖凝胶DNA回收和纯化试剂盒(天根，北京)进行纯化，应用高通量测序的方法(Illumina Miseq Platform)测定16S rDNA基因序列V3片段分析烟株根际土壤微生物群落特征。

1.4.4 数据分析 采用 Microsoft Excel 2003整理数据，应用SPSS 16.0软件对烟草农艺性状和经济性状进行方差分析，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较(P<0.05)。

使用Qiime2软件中的DADA2插件对原始序列(input)进行质量控制(filtered)，去噪，拼接，并且去嵌合体，形成操作分类单元(Operational Taxonomic Units, OTU)。对OTU进行丰度、多样性指数等分析，对物种进行注释并在门分类水平上进行群落结构的聚类分析和统计比较分析，分析各处理之间的微生物群落结构差异。

2 结果与分析

2.1 巨大芽孢杆菌对烤烟主要农艺性状的影响

由表1可知，施用巨大芽孢杆菌各处理的烟株的株高、茎围、节距、单株有效叶片数、腰叶长和宽均高于对照处理，其中A2处理各农艺性状与对照间差异均达到显著水平(P<0.05)，A1和A5与对照差异不显著，A3和A4在茎围上显著高于对照，其他农艺性状与对照无显著差异。可见，施用巨大芽孢杆菌有助于烤烟的生长，其中A2处理效果最佳。

表1 烤烟主要农艺性状方差分析

2.2 巨大芽孢杆菌对烤烟主要经济性状的影响

由表2可知，除667 m2产量外，菌剂各处理的667m2产值、均价和上等烟比例均显著高于对照处理(P<0.05)，较对照分别提高0.4%～1.3%、3.4%～7.4%、2.1%～5.8%、2.8%～7.1%。其中A2处理各经济性状最佳，667m2产值、均价和上等烟比例显著高于其他处理(P< 0.05)。由此可见，施用巨大芽孢杆菌可提高烤烟的经济效益。

表2 烤烟主要经济性状方差分析

2.1 巨大芽孢杆菌对烤烟根际土壤微生物的 影响

2.2.1 巨大芽孢杆菌对土壤微生物群落组成的影响 图1为施用巨大芽孢杆菌后不同时期(F-移栽后30 d、S-移栽后60 d、T-移栽后90 d)土壤微生物群落组成门分类水平的热图。由图可知，移栽后30 d，土壤微生物主要优势菌群有变形菌门、放线菌门和厚壁菌门，与对照相比，巨大芽孢杆菌处理的样品中厚壁菌门比例显著提高。移栽后60 d，土壤微生物群落优势菌群主要有变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门、厚壁菌门和拟杆菌门(Bacteroidetes)。移栽后90 d，土壤微生物主要优势菌群为放线菌门、变形菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和绿弯菌门。综上可知，该区域土壤微生物主要优势菌群为变形菌门和放线菌门，该优势贯穿烤烟整个生育期，另有酸杆菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、拟杆菌门等在特定时期表现出一定的优势，芽孢杆菌属于厚壁菌门，该菌在施用后30 d表现为优势菌群，随着生育期的推进优势逐渐减弱。

2.2.2 不同时期土壤微生物群落多样性指数分析 图2为移栽后60 d，芽孢杆菌各水平处理土壤微生物群落多样性指数，由图可知，不同施用水平处理 Chao1多样性指数、faith_pd、Simpson指数以及OTU数量均极显著显著高于对照(P<0.01)。其中chao1指数A4最高，其次为A1，且A1、A2和A5显著高于对照(P<0.05)。除了A3处理与对照差异不显著外，其他各处理faith_pd指数和OTU数量均显著高于对照。Simpson指数在A1处理中最高，其次为A2和A3，芽孢杆菌各水平处理均显著高于对照(P<0.05)。

2.2.3 群落组成差异分析 图3为不同处理之间β多样性分析PLS-DA图，由图可知对照与其他施用菌剂的处理距离较远，说明菌剂各水平处理与对照间差异较显著，AUC曲线中所得比值为1，图中所示施用菌剂各处理也存在明显的差异，特别是移栽后30 d和90 d。移栽后60 d的分析结果中，A1与其他各处理差异显著(P<0.05)，其余处理间差异不显著。

3 讨论与结论

本研究通过巨大芽孢杆菌不同施用量和对照进行对比分析，结果表明，施用巨大芽孢杆菌可有效促进烤烟生长，提高烤烟产量、产值、均价及上等中等烟比例，显著增加烤烟经济效益，该结论与王勇乾等[15]、徐宗昌等[16]研究结果基本一致。同时，菌剂的施用改变了烤烟根际土壤微生物群落特征，本研究结果表明，该区域土壤微生物优势菌群主要为变形菌门和放线菌门，该菌群优势在烤烟生长始末均一直保持，其他菌群在烤烟生长的不同时期表现出优势或优势减弱，本试验采用的巨大芽孢杆菌为厚壁菌门，研究发现，在移栽后30 d时，该菌群优势明显，随着生育期的推进，优势逐渐减弱，可能是到6月后，该地区温度上升，雨量增加，致使其他细菌类群繁殖旺盛，该菌群优势相对减弱。微生物多样性指数在移栽后60 d，即烤烟旺长期，各菌剂处理均显著高于对照，且各处理间微生物群落结构差异显著。

在农田生态系统中，土壤微生物具有不可忽视的作用，它们参与有机物的分解与合成、腐殖质的形成及养分循环等重要的生态过程[17-18]。微生物菌剂的施用改变原有土壤微生物群落组成、群落结构及种群多样性，影响生态系统的物质循环、能量转换和生态功能[19]，进而影响烤烟的生长。刘智炫等[13]研究表明，接种根际促生菌能降低烟田土壤容重和固相比，提高土壤总孔隙度，有利于烤烟生育后期土壤田间持水量的提高。王勇乾等[15]研究发现，解磷细菌肥配施磷肥可极显著提高烤烟根际土壤有效磷含量和土壤微生物对碳水化合物、氨基酸以及胺类碳源的利用能力。黄正强等[20]研究表明，冲施微生物菌剂增添了土壤中有益微生物菌群，提高了化肥利用率，促进了烟草生长发育，其中施用菌剂处理增产6.1%，净增值223.83元/667m2。

综上所述，施用微生物菌剂在一定程度上可通过改善土壤理化条件，促进烤烟生长，提高其经济效益，但是不同的菌剂种类、施用时间、施用方式、施用量以及不同烟区，其效果不尽相同，因此，微生物菌剂的施用应根据所在烟区存在的主要问题，因时因地制宜，才能取得较理想的效果。