西藏那曲牦牛BRDC细菌病原核酸检测与分析

王方国，耿尚景超，颜新敏，陈胜利，郝华芳，曾江勇，姚学萍，储岳峰，曹随忠

(1.四川农业大学 动物医学院，成都 611130；2.中国农业科学院 兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046；3.西藏自治区农牧科学院 畜牧兽医研究所，拉萨 850009)

牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory diseases complex，BRDC)是危害世界养牛业的重要疾病，也是制约中国养牛业发展的一个重要疾病问题。BRDC是由传染性病原因子、牛免疫功能失调以及环境压力等导致的，主要表现为支气管肺炎的一种多因子疾病，其中传染性病原因子种类较多，包括多种细菌和病毒，如多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida, Pm)、睡眠嗜组织菌(Histophillussomni, Hs)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica, Mh)、化脓隐秘杆菌(Trueperellapyogenes, Tp)、牛支原体(Mycoplasmabovis, Mb)等细菌病原[1]，牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3)等病毒病原[2-3]。这些病原可单独或者混合感染，临床表现多样，有些还可以隐性感染。在美国，Johnson等[4]通过动物健康监测系统研究发现，21.3%的牛受到BRDC的影响，在牛死亡的病例中，BRDC为45%～55%。

西藏那曲牦牛(Bosgrunniens)主要生活在海拔4 400 m以上的高寒地区，牦牛养殖的健康发展关乎牧民的直接利益，也关乎当地生态和社会发展。近年来，呼吸道疾病逐渐成为威胁高原牦牛养殖业的重要疾病[5-6]。李坤等[7]检测发现西藏地区牦牛的牛支原体血清抗体阳性率为 44.32%(12/273)，四川红原地区牦牛牛支原体血清阳性率为50.81%(126/248)；而王冬经等[8]检测发现西藏(林芝、昌都、拉萨、山南、日喀则)2 126份牦牛血清的牛支原体抗体显示血清总阳性率为46.75%(994/2 126)。陈建春等[9]采用ELISA的方法对西藏、甘肃、青海、四川地区等896份牦牛血清进行多杀性巴氏杆菌抗体检测，结果显示牦牛血清抗体平均阳性率为15.74%(141/896)。格代[10]对甘南牦牛进行血液镜检，检测出多杀性巴氏杆菌平均阳性率4.3%(70/1 600)。BRDC病原种类繁多，牦牛群中已报道细菌病原包括牛支原体、多杀性巴氏杆菌，关于整体的BRDC细菌病原报道较少，为准确了解牦牛群中BRDC相关细菌病原的流行情况，对牦牛群呼吸道疾病防控具有重要的生产实践指导意义。因此，本研究运用同步检测多种BRDC病原的qPCR方法，对西藏那曲地区牦牛牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌和化脓隐秘杆菌进行核酸检测，了解西藏那曲地区BRDC细菌病原流行情况，并分析不同季节、不同性别、不同年龄、不同养殖模式等风险因素对上述5种呼吸道病原感染的流行病学特点，为科学防控牦牛BRDC提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2018年11月—2019年6月采集西藏那曲地572头牦牛鼻拭子样品，鼻拭子样品采集采用一次性无菌棉签深入鼻腔 10 cm 深度采集，置于灭菌试管，-20 ℃保存并运回实验室，具体样品信息见表1。

表1 样品信息

1.2 主要试剂与仪器

2×GoldstarTaqMan Mixture购自康为试剂有限公司；DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit, DP301-02)购自北京天根科技有限公司；质粒提取试剂盒(OMEGA Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ D6950-01)购自广州飞扬生物工程有限公司；CFX96荧光定量PCR仪购自BIO-RAD(美国)公司。

1.3 引物、探针设计与合成

根据GenBank中已公布的牛支原体引物和探针序列参照Sachse 等[11]研究，多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、化脓隐秘杆菌参照Mai等[12]研究，引物和探针信息见表2，引物和探针均由西安擎科生物有限公司合成。

表2 检测相关的引物和探针

1.4 阳性对照

根据GenBank中已公布的牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、化脓隐秘杆菌全基因序列，根据引物所处的位置和扩增目的条带长度，使用 Clone Manager 8.0 软件进行分析查找，选取目的基因序列，合成并克隆到质粒载体pUC57，克隆位点EcoRV，载体长度 2.7 kb，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成、克隆。具体序列见表3。

表3 扩增目的基因序列

1.5 DNA的提取

将采集的牦牛鼻拭子放入2 mL EP管并做好标记，加入1 mL pH 7.2 0.1 mol/L PBS缓冲液，在振荡器上振荡30 s，室温放置浸泡1 h，挤压干净后丢弃棉拭子，浸泡液12 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用DNA提取试剂盒按照说明书提取病原基因组DNA，并用分光光度计测定其浓度，-20 ℃保存，备用。

1.6 标准质粒提取

含有牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌和睡眠嗜组织菌靶基因片段质粒的工程菌，常规方法接种培养基摇菌(LB培养基)，离心取沉淀，用质粒提取试剂盒，按照说明书提取质粒，分光光度计测定浓度并计算靶基因拷贝数，并稀释为1×101拷贝/μL到1×108拷贝/μL，-20 ℃保存，备用。

1.7 牦牛鼻拭子样品qPCR检测

参考Mai等[12]和翟肖辉等[13]建立的方法进行，结果判定试验有效性判定：阳性对照标准曲线生成，阴性对照无荧光扩增曲线，阳性判定：样本拷贝数≥标准品102拷贝数，阴性判定：样本拷贝数<标准品102拷贝数。

2 结果与分析

2.1 5种病原在不同季节、性别、年龄以及养殖模式下的牦牛中流行情况

根据表4显示，5种病原阳性率最高的为 Mb 18.18%(104/572)，其次是Pm 11.89%(68/572)、Hs 7.17%(41/572)、Mh 6.99%(40/572)，Tp 5.77%(33/572)。不同季节流行情况为Mb 2019年夏季样品阳性率显著高于2018年冬季样品(P<0.05)，Pm和Tp 2019年夏季样品阳性率极显著高于2018年冬季样品(P<0.01)。Mb和Pm雌性牦牛阳性率高于雄性牦牛，差异不显著(P>0.05)，Mh、Hs和Tp雄性牦牛阳性率高于雌性牦牛，差异不显著(P> 0.05)。对不同年龄段牦牛检测结果为Mb、Tp阳性率在3～6岁牦牛中最高，差异性不显著(P>0.05)；Pm、Hs阳性率在7～12岁牦牛中最高，差异性不显著(P>0.05)；Mh阳性率在3～6岁牦牛中极显著高于其他两个年龄段(P< 0.01)。不同养殖模式下流行情况为Mb、Pm、Mh、Tp阳性率在集约化养殖模式下明显高于放牧和放牧+圈养养殖模式，Mb组间差异显著(P<0.05)。Pm、Mh和Tp组间差异极显著(P<0.01)；Hs组间差异不显著(P>0.05)。

表4 不同季节、性别、年龄以及养殖模式下牦牛呼吸道病原检测结果

2.2 多种病原混合阳性流行情况

混合阳性率调查结果如表5和图1所示，在572份样品中二重感染阳性率最高为6.64%(38/572)，其次三重感染阳性率为2.27%(13/572)，四重感染阳性率为0.70%(4/572)，五重感染阳性为0.18%(1/572)。不同病原混合感染阳性率最高的Mb/Pm为1.57%(9/572)，其次Mb/Pm/Mh阳性率为1.22%(7/572)，Mb/Mh阳性率为0.87%(5/572)，Mb/Hs阳性率为0.87%(5/572)。

表5 种病原混合感染调查结果

3 讨 论

呼吸道疾病综合征(BRDC)是由细菌或者病毒单独或者混合感染引起的，而且相关病原在我国不同地区均有相关报道，国内关于奶牛和肉牛BRDC的相关报道比较全面，牦牛群中也有发生BRDC的报道，涉及到的细菌病原包括牛支原体、多杀性巴氏杆菌等。准确了解西藏那曲牦牛群中BRDC相关病原的流行情况，对牦牛群呼吸道疾病防控具有重要的生产实践指导意义。张建华[14]采用间接ELISA、直接培养法和PCR检测全国30个规模化奶牛养殖场牛支原体感染情况，结果显示，血清抗体阳性率为52.31%(441/843)，病料检测阳性率为55.00%(33/60)，乳样检测阳性率为34.22%(373/1090)，表明牛支原体在规模化奶牛场流行严重。王冬经等[8]用ELISA对来自西藏全区(林芝、昌都、拉萨、山南、日喀则)的2 126份牦牛血清进行牛支原体抗体检测，结果检出阳性血清994份，总阳性率为 46.75%。这些结果说明牦牛群中已有牛支原体流行，且感染率较高。陈建春等[9]采用ELISA的方法对西藏、甘肃、青海、四川地区牦牛进行多杀性巴氏杆菌抗体检测，检测出平均阳性率为 15.74%(141/896)，四地阳性率分别为12.50%、17.13%、12.91%和23.95%。目前，国内已有牛源溶血性曼氏杆菌分离鉴定的相关报道，其发病率为9%～40%，致死率为25%～50%[15]。吴翠兰等[16]用PCR的方法检测患有呼吸系统疾病的牛肺脏组织(102 份)和鼻拭子(15 份)样品，结果显示溶血性曼氏杆菌的检出率分别为5.13%(6/117)。牛睡眠嗜组织菌感染率很高，但多不表现临床症状，该菌在犊牛中的检出率为 15%～50%[17]。国内关于睡眠嗜组织菌的报道较少。吴翠兰等[16]通过对肺脏组织和鼻拭子进行化脓隐秘杆菌检测，PCR检测出有呼吸道症状样品阳性率为20.5%(24/117)，分离培养阳性率为 2.6%、7.7%(9/117)。本次试验检测出西藏那曲地区牦牛存在不同程度的呼吸道病原感染，其中牛支原体、多杀性巴氏杆菌阳性率较高，阳性率分别为18.18%(104/572)，11.89%(68/572)。溶血曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、化脓隐秘杆菌阳性率较低，阳性率分别为6.99%(40/572)、7.17%(41/572)、5.77%(33/572)。

研究表明主要引起发病的呼吸道病原为牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌，2019年与2018年对比，牛支原体、多杀性巴氏杆菌阳性率有所增加，所以针对这3个病原的防控至关重要。5种病原在不同性别牦牛中差异不显著。不同年龄中溶血曼氏杆菌3～6岁牦牛显著高于其他2个年龄段牦牛。

饲养管理水平对牦牛的健康养殖有着重要作用[18]。本次试验集约化养殖场地只有一处，采集样品来源于其中患有呼吸道症状(如流鼻液、眼分泌物过多、卧底不起、精神沉郁)的牦牛，根据采样的实际调查发现，由于该采样点饲养管理不到位，饲养密度过高，虽然患病牦牛集中隔离，但是每天还是有新增发病牦牛出现，而集约化养殖模式下，牦牛饲养密度大，如果有一头牦牛染病不进行及时处理，会导致疾病传播更加迅速，牦牛大面积感染。所以导致西藏那曲牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌阳性率在集约化养殖模式下显著高于放牧以及放牧+圈养的养殖模式。

混合阳性的主要原因是由于饲养密度过大和未及时隔离病牛而造成的继发感染，Radaelli等[19]研究表明奶牛呼吸道病原混合感染的常见病原菌主要包括：多杀性巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌。张晓宇[20]用病原分离鉴定的方法对来自国内6大地区犊牛鼻拭子进行鉴定，发现牛支原体与多杀性巴氏杆菌混合感染率为0.42%(73/17 280)、牛支原体与溶血曼氏杆菌混合感染率为0.3%(52/17 280)。本次试验表明，牦牛呼吸道病原混合感染主要是牛支原体与其他病原混合引起，其中发现一例5种病原都存在的感染，说明西藏那曲地区混合感染主要病原为牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、化脓隐秘杆菌，且牦牛呼吸道病原之间的混合感染可以同时存在5种呼吸道细菌病原。

针对西藏那曲牦牛呼吸道5种细菌检测结果，建议采取以下措施：(1)本次调查阳性率最高的是牛支原体，由于目前尚无商品化的牛支原体疫苗，可通过泰乐菌素/替米考星饮水拌料和加强饲养管理进行预防。而对于多杀性巴氏杆菌建议免疫牛出败疫苗预防巴氏杆菌感染。(2)对于发病牦牛。针对本次集约化养殖的一个场地应当加强巡视，及时发现，及时隔离并制定合理的治疗方案进行治疗，免交叉感染，不同症状发病牛在隔离时应注意分开隔离，避免不同疾病的混合感染。(3)加强检疫。很多牦牛疾病的发生，都可以通过定期检疫及时发现，所以要及时对牦牛疾病进行检疫管理，便于兽医人员及时采取相应措施对疾病进行治疗。(4)引种管理。对于引种的外来种公牦牛，进行相关疾病的检查，检查结果为阴性后也需要一定的隔离期。(5)牦牛养殖场所做好环境卫生，对于进出饲养场所的人员、车辆做好清洁消毒工作。圈舍、物品进行定期消毒，搞好圈舍环境卫生有利于牦牛对于疾病的抵抗。(6)饲养管理。合理养殖密度和牛群结构有利于牦牛的健康发展。牦牛进行放牧饲养，所以冬天合理的补饲可以避免牦牛消瘦。综上所述，在西藏那曲地区存在牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌和化脓隐秘杆菌的感染，主要流行牛支原体和多杀性巴氏杆菌，且存在两种以上病原混合阳性，表明西藏牦牛养殖也面临BRDC的挑战，对牦牛疫病防控和健康养殖具有重要的指导意义。受调查地区牦牛中流行的细菌病原阳性率从高到低依次为Mb、Pm、Hs、Mh和Tp，表明Mb已成为西藏地区牦牛呼吸道的主要细菌性病原之一，Pm仍是西藏地区牦牛需要防控的重要病原。