基于HPLC 指纹图谱与多元化统计法的黄芩质量评价研究

连赟芳

（1.漳州片仔癀药业股份有限公司，福建 漳州 363000；2.福建省片仔癀天然医药研发企业重点实验室，福建 漳州 363000）

黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效，是中医临床常用清热药之一［1］。 黄芩具有多种化学成分，主要为黄酮类、甾体类、挥发油及多种微量元素［2］。 现代研究表明：黄芩中黄酮类的成分黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素具有抗癌、抗氧化等药理作用［3-6］。 中药指纹图谱能全面反映中药所含内在化学成分的种类与数量，进而有效表征中药的质量及稳定性［7］，同时结合多元化统计法进行数据分析，已成为国际公认的控制中药质量的有效手段之一［8］。 本研究通过收集30批黄芩样品，建立HPLC 指纹图谱，同时结合相似度评价、聚类分析、主成分分析（PCA）和偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA），进行多产地、多批次黄芩的质量评价，为黄芩中药资源、利用及质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

Waters Arc 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Waters 2998 光电二极管阵列检测器；Empower 3（2998）色谱工作站；METTLERAE XS-205DR 十万分之一电子天平、METTLERAE XPE504 万分之一电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；KQ 500DE 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

对照品黄芩苷（批号：110715-201821，纯度：95.4%）、黄芩素（批号：111595-201808，纯度：97.9%）、汉黄芩素（批号：111514-201706，供鉴别使用）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯（美国Merck 公司）；水为超纯水；磷酸为分析纯。

黄芩样品来源见表1。

表1 黄芩样品来源

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品各约10.0 mg，分别置100 mL 量瓶，加70%乙醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.1 mg／mL 黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品储备液。 分别精密量取黄芩苷对照品储备液、黄芩素对照品储备液、汉黄芩素对照品储备液各5 mL至100 mL 量瓶，加70%乙醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取黄芩样品粉末约0.3 g，精密称定，置250 mL 具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，超声提取30 min，取出，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件与系统适应性试验 采用Waters Arc高效液相色谱仪，色谱柱GL Sciences Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.2%磷酸（B）。 梯度洗脱程序：0～10 min，35%～45%（A）；10～15 min，45%～70%（A）；15～40 min，70%（A）；40～45 min，70%～35%（A）；柱温为20 ℃；流速为1.0 mL／min；检测波长为280 nm。 分别精密量取混合对照品溶液、供试品溶液5 μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

2.4 特征图谱方法学考察

2.4.1 色谱柱及参照物峰的选择及专属性考察 分别精密吸取供试品溶液5 μL，注入液相色谱仪，记录60 min 色谱图，考察色谱柱GL Sciences Inertsil ODS-3 C18、PX-C18、Waters SunFireTM C18、Ultimate XB-C18 及Thermo BDS HYPERSIL C18 5 个厂家的色谱柱，分析测定同一供试品。 实验结果表明：PX-C18、Ultimate XB-C18 分 析 柱 保 留 时 间 延后，Thermo BDS HYPERSIL C18 柱的分离效果不够稳定，故选择GL Sciences Inertsil ODS-3 C18 色谱柱。

采用GL Sciences Inertsil ODS-3 C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），记录60 min 色谱图，黄芩苷色谱峰在供试品色谱图上保留时间适中，且黄芩苷又是黄芩含量测定指标性成分，色谱峰面积最大，与相邻峰分离良好，故选择黄芩苷为参照物峰（S），按黄芩苷峰计理论塔板数应＞2 500。

分别考察混合对照品溶液色谱图、供试品溶液运行60 min 及120 min 色谱图，结果显示各组分在60 min 内均流出色谱柱，故确定样品的运行时间为60 min。 结果见图1。

图1 混合对照品溶液和供试品溶液高效液相色谱图

2.4.2 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6 次，计算各共有峰的相对保留时间（RRT）和峰面积比值（PAR）。 实验结果表明：各供试品溶液色谱峰RRT 的RSD＜0.1%，PAR 的RSD＜1.1%，符合规定。

2.4.3 重复性试验 分别取同一批样品6 份（编号S13），按“2.2”和“2.3”项下同法操作，进样，计算各共有峰的RRT 和PAR。 实验结果表明：各供试品溶液色谱峰RRT 的RSD＜0.1%，PAR 的RSD＜1.2%，符合规定。

2.4.4 稳定性考察 分别取同一供试品溶液，室温下保存，分别于0、2、4、6、8、12、14、16 h 处测定，计算各共有峰的RRT 和PAR。 实验结果表明：各供试品溶液色谱峰RRT 的RSD＜0.2%，PAR 的RSD＜1.2%，符合规定。

2.5 30 批黄芩指纹图谱的建立 按照“2.2”和“2.3”项下同法操作，将30 批黄芩样品HPLC 数据以AIA 格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012 版）”，以编号S13 样品作为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.5，经过多点校正-峰匹配，生成30 批黄芩样品指纹图谱叠加图及对照指纹图谱，见图2。

图2 30 批黄芩样品指纹图谱的叠加图及对照指纹图谱

2.6 相似度评价 分析评价30 批黄芩样品指纹图谱各批间以及各批与对照指纹图谱的相似度。 实验结果表明：30 批黄芩样品的相似度均大于0.990，符合指纹图谱建立要求（0.900～1.000）。 主要共有峰面积比值范围为1∶2∶3∶4∶5∶6∶7∶8∶9∶10∶11＝（0.005 8～0.029 8）∶（0.025 5～0.037 7）∶（0.018 1～0.034 1）∶（0.019 8～0.056 0）∶（1.000 0）∶（0.057 7～0.089 3）∶（0.058 4～0.096 7）∶（0.188 0～0.236 4）∶（0.029 4～0.247 7）∶（0.012 5～0.103 4）∶（0.003 1～0.038 5）。结果见表2。

表2 30 批黄芩样品相似度结果

2.7 共有峰的分析及归属 分析30 批黄芩样品指纹图谱，确定1～11 号为共有峰，共有峰保留时间（峰号）分别约为8.998 min（1）、13.736 min（2）、15.468 min（3）、18.146 min（4）、18.562 min（5）、19.584 min（6）、20.045 min（7）、20.418 min（8）、23.124 min（9）、28.395 min（10）、30.795 min（11）。其中，5 号峰为黄芩苷，9 号峰为黄芩素，10 号峰为汉黄芩素；相对保留时间（峰号）分别约为0.485（1）、0.740（2）、0.833（3）、0.977（4）、1.000（5）、1.055（6）、1.080（7）、1.100（8）、1.244（9）、1.527（10），1.656（11），其中5 号峰为参照峰S 峰。 以S 峰的保留时间和峰面积为基准，计算各共有峰的RRT 和PAR。

比较参照物色谱图、各批供试品色谱图，确定黄芩供试品色谱图的主要物质群特征峰及其归属，指纹图谱中5、9 和10 号峰为黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素。 实验结果表明：共有峰总面积占总峰面积97.36%，非共有峰面积占总峰面积2.64%，均符合指纹图谱规定。 结果见表3。

表3 黄芩样品指纹图谱成分峰归属分析

2.8 聚类分析 运用Minitab 20 软件，以30 批黄芩样品指纹图谱中11 个共有峰的峰面积为变量，选择最长距离联结法，距离度量为Euclidean，进行观测值聚类。30 批黄芩样品被聚为4 类。 样品编号S24 聚为一类，样品编号S1、S4～S5、S8～S9、S14、S26 聚为一类，样品编号S2、S12、S28～S30、S23 为一类，其余样品编号聚为一类。 说明不同产地的黄芩药材存在一定的差异。

2.9 基于PCA 的差异模型建立 采用Minitab 20 软件，以11 个共有峰峰面积为变量，对30 批黄芩样品进行PCA，选择相关矩阵类型，计算主成分特征值及累计贡献率。 结果表明特征值＞1 的主成分有3 个，且累计贡献率为85.9%，建立的指纹图谱基本能客观反映30 批黄芩的样本信息。

2.10 基于OPLS－DA 模型建立 以30 批黄芩样品HPLC 指纹图谱的11 个共有峰峰面积为变量，导入SIMCA-P 14.1 分析软件，启动OPLS-DA 分析程序，VIP 值＞1 的化合物对模型的贡献度较大。 经分析筛选不同批次黄芩样品质量差异的5 个峰，其影响程度依次为10 号峰（汉黄芩素）＞9 号峰（黄芩素）＞2 号峰＞4 号峰＞11 号峰，上述5 个峰可能是导致不同批次样品之间产生差异的主要原因。

3 讨 论

3.1 前期供试品溶液制备过程中，比较《中华人民共和国药典》（2020 年版）黄芩药材含量测定项供试品溶液制备，发现两种制备方法对化学成分的提取影响不大，考虑操作方便，故选择70%乙醇超声提取30 min制备供试品溶液。

3.2 实验分别比较了不同比例的流动相，如甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%冰醋酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液等，结果甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脱各色谱峰达到完全分离、基线平稳、峰形稳定，故选择甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脱为流动相。

3.3 通过相似度评价获得30 批黄芩样品指纹图谱相似度均大于0.990，表明该30 批黄芩样品具有相似的化学成分，存在较高一致性；通过聚类分析30 批黄芩样品聚为4 类，表明不同产地黄芩药材存在一定的差异；PCA 结果显示特征值＞1 的3 个主成分能基本反映30 批样品信息；OPLS-DA 结果显示影响黄芩质量的因素，主要为黄芩素、汉黄芩素、2 号峰、4 号峰和11 号峰，不包括《中华人民共和国药典》规定含量测定成分黄芩苷，说明不同批次、不同产地黄芩所含黄芩苷含量差异不大，提示采用单一成分定量无法真实评判黄芩质量优劣。

3.4 本研究以30 批黄芩样品作为研究对象，建立HPLC 指纹图谱，精密度、重复性、稳定性试验中RRT 和PAR 的RSD 小于3.0%，均符合要求。 同时结合相似度评价、PCA、聚类分析、OPLS-DA 综合评价多批次黄芩样品的整体质量，为中医临床用药选择、黄芩质量标准提高及黄芩相关制剂质量研究提供依据。