宁南霉素对烟草叶片内生细菌多样性的影响

车红兵，蔡永占，何鹏飞，吴毅歆，何鹏搏，赵崇钧，孔宝华**，何月秋**

(1.云南农业大学，云南 昆明 650201；2.云南省烟草公司 曲靖市公司，云南 曲靖 655000；3.云南省微生物发酵工程研究中心有限公司，云南 昆明 650107)

我国是第一大烟草生产国，烟叶产量约占世界总产量的30%，但烟草由病虫害造成的损失达10%～15%[1]。烟草病虫害主要是依靠化学农药控制的，但化学农药防治存在农药残留、病虫易产生抗性等缺点，同时易降低烟叶品质，破坏生态环境，影响人类健康。宁南霉素是中国科学院成都生物研究所从四川省宁南县土壤分离到诺尔斯链霉菌西昌变种(Streptomycesnourseivar.xichangensis)发酵产物中分离到的一种抗生素，它已被登记为烟草花叶病毒病、番茄病毒病、辣椒病毒病、水稻立枯病、大豆根腐病、水稻条纹叶枯病、苹果斑点落叶病、黄瓜白粉病等病害抗生素。生物防治因安全性好而成为病虫害防治研究的热点[2-3]。植物有益内生细菌能够促进宿主植物的生长，提高宿主植物的抗病虫害能力，增强宿主植物的抗逆性[4]，已被用作生物防治的主要资源。如烟草内生解淀粉芽孢杆菌YN201732(BacillusamyloliquefaciensYN201732，下称Y32)，它能够很好地防治烟草白粉病以及促进植物生长[5-6]。化学农药和抗生素在病虫害防控中发挥了重要作用，但它们可能同时影响了植物有益内生菌数量与种群结构，使植株处在农药单一的保护之下，从而弱化了内生菌功能。为了证明这一假设，本文采用16S rDNA高通量测序技术，测定了宁南霉素对烟草内生菌群落结构的影响，以期从微生态的角度证明生物防治的可行性，为避免滥用化学农药和抗生素类农药造成对活菌生物防治负面影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

K326烟苗，由云南省微生物发酵工程研究中心有限公司提供，于移栽后90 d开始试验。10%宁南霉素可湿性粉剂(WP)由德强生物股份有限公司生产。Y32和其绿色荧光标记菌株YN32-P43GFPmut3a(下称Y32GFP)为本实验室保存菌株。

1.2 材料的预处理

菌株发酵液的制备：将保存的Y32和YN32GFP接种于无菌LB培养液中，在37 ℃、160 r/min恒温摇床中培养3 d，用0.2%吐温制成浓度为107cfu/mL的发酵液，备用。

1.3 试验方法

试验共设置7个处理，即a为喷施Y32GFP发酵液；b为喷施Y32发酵液(Y32WT)；c为喷施10%宁南霉素WP(N)；d为先喷Y32GFP发酵液，24 h后再喷施10%宁南霉素WP(Y32GFPN)；e为先喷10%宁南霉素WP，24 h后再喷施Y32GFP发酵液(N32GFP)；f为喷施液体LB(LB)；g为喷施清水(W-CK)。每处理重复3次，每个重复3株苗，共计63株。

分别在处理后第1天(2020年9月5日)取样，样品编号为：W-CK-5、LB-5、Y32WT-5、Y32GFP-5、N-5、Y32GFPN-5、N32GFP-5；第3天(2020年9月7日)取样，样品编号为：W-CK-7、LB-7、Y32WT-7、Y32GFP-7、N-7、Y32GFPN-7、N32GFP-7；第5天(2020年9月10日)取样，样品编号为：W-CK-10、LB-10、Y32WT-10、Y32GFP-10、N-10、Y32GFPN-10、N32GFP-10。用灭菌剪刀从各处理植株相同部位剪取叶片，75%酒精表面消毒，无菌水冲洗后装于自封袋中，液氮速冻，干冰寄送至广州基迪奥生物公司做内生菌高通量测序。

从样本中提取基因组DNA后，用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V5～V7区。引物序列为：799F：AACMGGATTAGATACCCKG；1193R：ACGTCATCCCCACCTTCC。将纯化后的扩增产物(即扩增子)连接测序接头，构建测序文库，于Illumina平台 PE250上机测序。

2 结果与分析

2.1 数据质控

本次试验样品细菌测序共获得高质量序列7204478条，其中最大序列长度 474 bp，最短序列长度 201 bp。本次实验的序列具有较高的完整性，数据有效性好，可以用于本次样品细菌群落分析。

2.2 Alpha多样性分析

用序列数和Shannon指数构建样本的稀释曲线，用于验证测序数据量是否足够反映样本的内生菌群信息。随着序列数的增加，各样本曲线都逐渐变得平坦，即使再增加测序数量也只会产生很少新的OTUs，说明测序数据量较为合理，能够反映烟草叶片样本中绝大多数的内生菌群信息。

本次测序所有样品的覆盖度指数均大于0.99，表明测序结果能准确地反映烟草叶片中实际的细菌菌群(表1)。各样品的Alpha多样性指数(Simpson指数、Shannon指数、Ace指数和Chao1指数)中，Shannon和Simpson指数表示物种多样性，Shannon指数数值越大表示物种多样性越高；Simpson指数数值越大或越小表示物种多样性越高，其计算公式为1-∑(Pi)2。Ace指数和Chao1指数表示物种丰富度，其数值越大表示物种丰富度越高。

表1 烟草内生细菌多样性指数分析结果

在第1天所取样品中，只喷施Y32发酵液处理(Y32WT-5)的Simpson指数和Shannon指数分别为0.76±0.002和2.25±0.01，均大于只喷施宁南霉素(N-5)处理的0.10±0.05和0.39±0.14，大于先喷施宁南霉素，24 h后再喷施Y32GFP发酵液(N32GFP-5)处理的0.53±0.24和2.20±1.51，大于先喷施Y32GFP发酵液，24 h后再喷施宁南霉素(Y32GFPN-5)处理的0.16±0.17和0.64±0.58，大于清水对照(W-CK-5)的0.31±0.28和1.06±0.87。在第5天所取样品中，只喷施Y32发酵液处理(Y32WT-10)的Simpson指数和Shannon指数分别为0.77±0.01和2.28±0.11，大于只喷施宁南霉素(N-10)处理的0.41±0.25和1.14±0.57，大于先喷施宁南霉素，24 h后再喷施Y32GFP发酵液(N32GFP-10)处理的0.40±0.26和1.10±0.62，大于先喷施Y32GFP发酵液,24 h后再喷施宁南霉素(Y32GFPN-10)处理的0.23±0.12和0.79±0.33，大于清水对照(W-CK-10)的0.60±0.09和1.82±0.31。综上所述，在第1天所取样品和第5天所取样品中，只喷施Y32发酵液的处理(Y32WT-5和Y32WT-10)，其物种多样性高于只喷施宁南霉素(N-5和N-10)，先喷施宁南霉素，24 h后再喷施Y32GFP发酵液(N32GFP-5和N32GFP-10)，先喷施Y32GFP发酵液，24 h后再喷施宁南霉素(Y32GFPN-5和Y32GFPN-10)和清水对照(W-CK-5、W-CK-10)等处理，说明宁南霉素会降低烟草叶片内生细菌多样性，而生防菌Y32发酵液能够提高烟草叶片内生细菌的物种多样性。

在所有样品中，只喷施Y32发酵液的处理(Y32WT-5、Y32WT-7、Y32WT-10)，第1天所取样品的Simpson指数为0.76±0.002，大于第3天所取样品的Simpson指数0.61±0.34，小于第5天所取样品的Simpson指数0.77±0.01；Shannon指数的变化规律与Simpson指数相同。只喷施Y32GFP发酵液的处理(Y32GFP-5、Y32GFP-7和Y32GFP-10)也呈现上述规律。而只喷施宁南霉素的处理(N-5、N-7和N-10)第1天所取样品的Simpson指数为0.10±0.05，第3天所取样品的Simpson指数为0.77±0.04，第5天所取样品的Simpson指数为0.41±0.25；先喷施Y32GFP发酵液，24 h后再喷施宁南霉素(Y32GFPN-5、Y32GFPN-7、Y32GFPN-10)的处理，第1天所取样品的Simpson指数为0.16±0.17，第3天所取样品的Simpson指数为0.53±0.40，第5天所取样品的Simpson指数为0.23±0.12；先喷施宁南霉素，24 h后再喷施Y32GFP发酵液(N32GFP-5、N32GFP-7、N32GFP-10)的处理，第1天所取样品的Simpson指数为0.53±0.24，第3天所取样品的Simpson指数为0.75±0.06，第5天所取样品的Simpson指数为0.40±0.26，通过数据比较发现它们的Simpson指数都随时间呈先上升后下降趋势；Shannon指数的变化规律与Simpson指数相同。综上所述，只喷施宁南霉素的处理(N-5、N-7和N-10)与宁南霉素和Y32GFP发酵液不同先后喷施组合处理(Y32GFPN-5、Y32GFPN-7、Y32GFPN-10、N32GFP-5、N32GFP-7和N32GFP-10)，其物种多样性随时间呈先上升后下降趋势，这一结果进一步证明生防菌能够提高烟草叶片内生细菌的物种多样性，同时也证明宁南霉素会降低烟草叶片内生细菌的物种多样性。

从Chao1指数和Ace指数来看，其变化规律基本与Simpson指数、Shannon指数相似，即宁南霉素会降低烟草叶片内生菌的物种丰富度(表1)。

2.3 内生细菌群落组成

在属分类水平上，对相对丰度进行排名，生成物种相对丰度表(表2)。所有样品中优势细菌属均为泛菌属(Pantoea)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和假单孢菌属(Pseudomonas)，它们的相对丰度之和大于80%。先喷施Y32GFP，发酵液，24 h后再喷施宁南霉素的处理(Y32GFPN-5、Y32GFPN-7和Y32GFPN-10)中芽孢杆菌属的相对丰度高于先喷施宁南霉素，24 h后再喷施Y32GFP发酵液的处理(N32GFP-5、N32GFP-7和N32GFP-10)；随着时间的延长，芽孢杆菌属的相对丰度逐渐下降，但始终是先喷施Y32GFP发酵液，24 h后再喷施宁南霉素的处理(Y32GFPN-5、Y32GFPN-7和Y32GFPN-10)中芽孢杆菌属的相对丰度高于先喷施宁南霉素，24 h后再喷施Y32GFP发酵液的处理(N32GFP-5、N32GFP-7和N32GFP-10)，表明宁南霉素残存对施入的Y32GFP及烟草内生细菌有负面影响。只喷施宁南霉素的处理(N-5、N-7和N-10)中内生细菌种类及相对丰度均低于其他处理，而且随着时间的延长，其内生优势菌属细菌的相对丰度下降较快，这影响了烟草叶片内生菌群的平衡，不利于烟株生长及抵抗病虫害侵袭，进一步说明宁南霉素对施入的Y32GFP及烟草内生菌有影响。从第1天所取样品来看，在喷施Y32发酵液、Y32GFP发酵液和宁南霉素组合的处理中，虽然芽孢杆菌属的相对丰度较高(这主要是由于喷施了生防菌Y32GFP)，但几乎没有或很少对其他烟草内生菌产生影响。

2.4 Beta多样性分析

基于unweighted unifrac距离的PCoA分析烟草叶片内生细菌群落组成的结果(图1)显示，在属水平，第1主成分PCo1和第2主成分PCo2对样品的贡献率分别为44.43%、8.85%，它们是影响烟草叶片内生细菌群落结构的主要因素，且PCo1的贡献率显著大于PCo2。在所有样品中，由于PCo2的作用Y32WT-5和Y32GFPN-7间距离较近，细菌群落组成相似，其余样品均表现为在PCo1作用下第3天所取样品和第5天所取样品距离较近，细菌群落组成相似，均与第1天所取样品距离较远，细菌群落组成差异较大。同一时间不同处理，第1天所取样品，在PCo2作用下分为上下两组，除Y32GFP-5和Y32GFPN-5距离较近外，其相邻处理间距离均相差不大。第3天所取样品和第5天所取样品N32GFP-7和LB-10聚在一起，细菌群落组成差异较小；Y32GFP-10和W-CK-10及W-CK-7聚在一起，细菌群落组成差异较小；其余处理聚在一起。

图1 在属水平上烟草叶片内生细菌主坐标分析结果

利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)Pathway数据库，即代谢通路数据库，比对烟草叶片样品内生细菌 OTU对应的基因，进行PICRUSt2基因预测。结果(图2、图3)显示，第1天、第3天、第5天所取样品中，在处理Y32GFPN-5、Y32GFPN-7和Y32GFPN-10中新陈代谢、遗传信息处理和细胞过程的相对丰度始终高于N32GFP-5、N32GFP-7和N32GFP-10处理。第1天和第3天所取样品中，Y32GFP-5和Y32GFP-7处理的新陈代谢和遗传信息的处理相对丰度高于N-5、N-7处理、N32GFP-5和N32GFP-7的处理。说明Y32GFP发酵液能够有效提高烟草叶片生命代谢活动，加快生命进程，这有利于植物生长、增产，也可能是由于生防菌Y32激活了烟草系统抗性。

表2 烟草叶片内生细菌在属水平上的相对丰度

图2 在OTU水平上烟草叶片内生细菌KEGG代谢通路的相对丰度

图3 在OTU水平上烟草叶片内生细菌功能的分类

3 讨论

农药是防治植物病虫害的最有力武器。大量使用或者滥用农药其副作用明显，如破坏环境、引起抗性病虫的出现、影响植物内生细菌群落结构，以及危害人体健康。本研究以宁南霉素为例，证明了广谱杀菌剂影响植物内生细菌物种的多样性。所得结果表明，只喷施生防内生菌Y32GFP发酵液的处理，其物种多样性高于只喷施宁南霉素、先喷施宁南霉素，24 h后再喷施Y32GFP发酵液、先喷施Y32GFP发酵液，24 h后再喷施宁南霉素和清水对照等，这说明生防菌能够提高烟草叶片内生细菌的物种多样性和丰度，宁南霉素会降低烟草叶片内生细菌的物种多样性和丰度。

在先喷施Y32GFP发酵液，24 h后再喷施宁南霉素的处理中，其新陈代谢、遗传信息处理和细胞过程的相对丰度始终高于先喷施宁南霉素，24 h后再喷施Y32GFP发酵液处理，说明大量植物内生菌与根围促生菌能诱导植物获得系统抗性[7]。此外，在烟草叶片中还发现了泛菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属等有益细菌。傅蕾等[8]发现泛菌属(Pantoea)菌株PP04在100 mmol/L盐胁迫下对杂交狼尾草具有明显的促生作用与效果，且可通过缓解氧化胁迫对植物造成的损伤，显著提高植物对盐胁迫的耐受性。沙雷氏菌属细菌因具有对昆虫的高致病性和对害虫生物防治的巨大潜力而受到国内外学者的广泛关注。已有研究表明，粘质沙雷氏菌可感染烟青虫[9]、蚜虫[10]、白蚁[11]、蝗虫[12]、天牛[13]、红棕象甲[14]、黄曲条跳甲[15]等多种害虫，是一类重要的昆虫病原细菌。假单胞菌属中的荧光假单胞菌对烟草黑胫病具有生防作用，恶臭假单胞菌有耐金属作用[16-17]，也就是说植物内生菌参与了植物生存的各个方面，并发挥着重要作用；仅用化学农药或者植物生化农药(抗生素等)，不仅降低了植物内生菌多样性，弱化了有益内生菌的功能，打破了植物内生菌群平衡，导致植物抗逆性及抗病虫害能力下降，而且污染环境、危害人体健康。因此，在实际应用这些农药产品时，除考虑效果、农产品安全、环境友好外，还要关注它们对植物内生菌多样性的影响。