蛹虫草浅层发酵产虫草素培养基优化

邹亚男，刘庆国，王松涛，赵 南，陈 勇，应汉杰

(1.南京高新工大生物技术研究院有限公司,江苏 南京 210061；2.泸州品创科技有限公司,四川 泸州 646099；3.南京工业大学,江苏 南京 211816)

近年来的研究证实了蛹虫草的活性物质明显高于冬虫夏草，可以作为冬虫夏草的替代品[1-2]。现代科学论证蛹虫草不仅具有特殊的营养价值，而且有明显的药用价值,其中尤以虫草素活性物质的药用价值最为显著[3]。

目前，虫草素合成方法主要有化学合成法和生物发酵法2种。化学合成工艺复杂，产物回收率低，生产成本高；而生物发酵法是通过蛹虫草发酵获得，方法简单，反应条件温和，易于工业化生产。不同研究者通过培养基配方优化等以获得高产虫草素的培养条件或蛹虫草菌株[4-6]。文庭池等[7]考察了蛹虫草菌株在通过光照振荡、光照静置、黑暗振荡、黑暗静置4种培养方式和添加前体物质，发酵60 d后，发酵液内虫草素和腺嘌呤含量变化，结果表明:CM3菌株在静止培养及添加前体时虫草素的含量达2.54 g/L，腺嘌呤利用率达99.79%。荆留萍等[8]研究了不同前体物及营养物对蛹虫草液体发酵中虫草素和虫草多糖含量的影响，结果显示：腺苷、核糖、谷氨酰胺、甘氨酸均能明显提高虫草素及虫草多糖的含量，其最适添加量分别为4、2～3，0.5～1.0、0.5 g/L。Shih等[9]以蛹虫草CCRC 32219为研究对象，考察了初始pH值、不同氮源、植物油和培养方式(摇瓶和静态培养)对虫草生物量和虫草素产量的影响，结果表明：酵母提取物和玉米浸渍粉对虫草素合成有显著提升作用，并且C/N比低也有利于虫草素的生产，植物油可以促进蛹虫草的菌丝生长，但对虫草素的产生影响不大，在最佳条件下，虫草素的最大产量为2.2 g/L。

笔者分析了不同碳源、前体物质及微量元素等对虫草素发酵的影响，以期找到提高虫草素含量的发酵途径，为虫草素研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株C.militarisCGMCC18581由C.militarisCICC14014经物理化学复合诱变所得，保藏于南京高新工大生物技术研究院(CY1909)与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

1.1.2 试剂 葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠均采购于国药集团化学试剂有限公司；酵母蛋白胨、安琪酵母粉均采购于市场；蛋白胨和酵母粉均为OXOID；腺嘌呤、腺苷、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸均采购于上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培养基 (1)固体培养基：土豆200 g煮沸过滤取汁，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，维生素B1 0.1 g，琼脂15 g，定容至1 L，pH值自然。

(2)种子培养基：葡萄糖40 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，磷酸氢二钾0.2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，pH值5.8。

(3)发酵基础培养基：葡萄糖40 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，磷酸氢二钾0.2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，吐温-80 0.5 g/L，腺嘌呤4 g/L，pH值5.8。

1.2 仪器与设备

SX-700立式全自动灭菌锅(由TOMY公司生产)；ZQZY-CF震荡培养箱(由上海知楚仪器有限公司生产)；SW-CJ-1BU超净工作台(由苏州安泰空气技术有限公司生产)；GENESYS 10S UV-Vis紫外可见分光光度计；Agilent1260高效液相色谱仪。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株培养条件 (1)斜面菌株培养：将试验室保藏的蛹虫草菌株转接至固体培养基，25 ℃恒温培养5～7 d，获得斜面菌种。

(2)种子培养：刮取培养好的斜面菌丝体接种至装有200 mL种子培养基的1 L三角瓶中，25 ℃，180 r/min恒温震荡培养3～4 d。

(3)发酵培养：按10%接种量接种至装有200 mL发酵培养基的1 L三角摇瓶中，25 ℃下静置发酵3～4周。

1.3.2 氮源优化试验 采用不同品牌的蛋白胨、酵母粉进行氮源优化，按总氮量换算廉价氮源的添加量。具体配方见表1。

表1 不同氮源组合

1.3.3 单因素优化 (1)单因素优化试验。金属离子为MnSO4、ZnSO4、CuSO4、CaSO4、FeSO4，浓度0.04 g/L；前体物质为腺嘌呤、甘氨酸组合优化试验。

(2)单因素爬坡试验。将最适蛋白胨质量浓度调至30～50 g/L，最适酵母粉的质量浓度调至3～20 g/L，微量元素质量浓度调至0.02～0.14 g/L。

1.3.4 响应面设计试验 根据单因素爬坡试验结果,对蛋白胨、酵母粉、硫酸亚铁和前体物质4个因素进行Box-Benhnken试验，每个因素取3个水平，响应值为虫草素产量，具体试验设计见表2。

表2 响应面试验设计 g/L

1.4 样品检测方法

1.4.1 虫草素检测 取发酵液，10000 r/min离心10 min。上清液用容量瓶稀释20倍后，经0.22 μm滤膜过滤，得到待测样品液。采用液相色谱法测定虫草素含量。

高效液相色谱条件：色谱柱Sepax HP-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，120Å；检测器：紫外线，波长：254 nm；柱温：30 ℃；流动相：甲醇∶磷酸二氢钾=25∶75；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL。根据色谱峰保留时间进行定性分析，以外标峰面积法进行定量分析。

1.4.2 总氮检测方法 采用全自动凯氏定氮仪K9860检测。

1.4.3 氨基酸检测 参照白岚[10]的研究文献。

1.4.4 数据处理方法 采用Origin 8.1软件进行数据统计分析和作图。Box-Behnken响应面设计采用Design Expert软件。

2 结果与分析

2.1 氮源优化

由图1所示，编号1、3、9虫草素产量较高，其中编号1为OXOID的蛋白胨和酵母粉，成本较高，不采用；而编号3为信和酵母蛋白胨和编号9安琪酵母粉FM139分别是相对较佳的蛋白胨和酵母粉。

图1 不同氮源组合对虫草素发酵的影响

从表3可知，在2种配方中，各氨基酸成分较为一致，且谷氨酸、天冬氨酸含量较高，该结果说明2种配方相似组分保证了发酵效果的一致性。

表3 2种氮源组合下培养基中各氨基酸浓度 g/L

2.2 微量元素优化

由图2可以看出，Mn2+、Cu2+、和Ca2+对虫草素合成无明显作用，甚至有一定的抑制作用；Zn2+对虫草素产量提高有一定的促进影响，但效果不显著。而添加少量Fe2+可以显著提升虫草素的积累量。

图2 不同金属离子浓度对虫草素产量的影响

2.3 前体物质优化

由表4可知，在不加腺嘌呤条件下，虫草素产量随着甘氨酸添加量的提高而提高，将甘氨酸浓度提高至12 g/L以上，对虫草素产量提高的贡献度较低。在添加2 g/L的腺嘌呤后，虫草素产量提高显著，甘氨酸浓度达8 g/L以上时，虫草素提高不明显。另外，当添加4 g/L的腺嘌呤条件下，甘氨酸从0提高到8 g/L，虫草素产量同样提高不显著。由于腺嘌呤价格远高于甘氨酸，结合发酵的效果，将腺嘌呤和甘氨酸添加量分别设定为2和8 g/L。

表4 不同腺嘌呤和甘氨酸组合对虫草素产量的影响

2.4 单因素爬坡试验

分别选择单因素试验中发酵效果最好的廉价氮源(信和酵母蛋白胨、安琪酵母粉)和金属离子(硫酸亚铁)进行爬坡试验(图3)。当信和酵母蛋白胨、安琪酵母粉、硫酸亚铁浓度分别采用45 g/L、7 g/L、0.08 g/L时，虫草素的产量最高。

图3 氮源和金属离子对虫草素产量的影响

2.5 响应面优化设计

使用爬坡试验中获得的各因子对应的虫草素产量最高点为中心进行响应面设计并开展试验，以蛋白胨、酵母粉、硫酸亚铁、腺嘌呤/谷氨酸为自变量，以虫草素含量(Y)为响应值，其方案与结果见表5。虫草素产量与自变量之间的回归方程达极显著水平(P<0.0001)，失拟项P=0.1770不显著，表明失拟项影响效果较小，模拟的拟合程度较好[11]。由此表明该模型建立成功，并可以利用该模型对虫草素产量进行分析及预测。利用Desigin-Expert 8.0.6 软件对数据进行拟合，得到其回归方程：Y=-4.62+0.15A+0.54B+51.98C+0.60D-0.0013AB-0.25AC+0.0023AD-0.80BC-0.019BD-0.31CD-0.0013A2-0.022B2-249.22C2+0.14D2。

表5 响应面试验结果分析

利用软件计算分析优化得到4个因素的最佳质量浓度为信和酵母蛋白胨52.25 g/L，利用软件计算分析优化得到4个因素的最佳质量浓度分别为信和酵母蛋白胨52.25 g/L、安琪酵母粉8.43 g/L、硫酸亚铁0.06 g/L、腺嘌呤3 g/L+甘氨酸12 g/L。在该方程模拟预测下的虫草素产量为6.21 g/L，在此条件下进行验证，测得虫草素产量6.35 g/L，与预测的产量相差2.25%。此外，该4个因素在发酵过程中的相互作用分析见图4。

图4 不同变量交互作用对虫草素产量的影响曲面图

3 讨论与结论

本试验首先通过对不同氮源以高产虫草素为指标进行筛选，最终确定有效提高虫草素产量的为信和蛋白胨和安琪酵母粉。通过氨基酸组分分析，这2种氮源与价格昂贵的OXOID蛋白胨和酵母粉组分相似,且谷氨酸含量均较丰富。有研究表明，谷氨酰胺物能大幅提高蛹虫草液体发酵胞外虫草素的产量[12-14],而谷氨酸是谷氨酰胺的前体物质，故对虫草素合成也有明显促进效果。

根据报道表明，腺苷是虫草菌素的直接前体，腺嘌呤又是腺苷的前体，故腺嘌呤对虫草素合成有明显的正向调控作用[15-17]。甘氨酸与虫草素没有直接的关联，但可能影响虫草素前体物质的合成。因为本试验在没有添加腺嘌呤和其他前体物质条件下，添加适量甘氨酸，虫草素产量有显著提高。本试验筛选的最优添加方式是2 g/L的腺嘌呤和8 g/L的甘氨酸组合。2种前体及营养物能够通过协同互补作用提高胞外虫草素的产量,这与文庭池等[18]研究的结果较为一致。

表6 回归模型方差分析

另外，根据叶晶晶等对1株蛹虫草DY-1菌株进行液体发酵配方优化研究结果，发现铁离子对菌丝体生长有显著促进作用，而虫草素产量与菌体生长量呈正相关[19]。研究表明，硫酸亚铁能调节基因转录水平，从而提高虫草素合成[20]}。本试验结果显示：FeSO4低浓度对虫草素积累量的影响较大，这与秦鹏等的研究结果相近[21]。

综上所述，本研究为蛹虫草发酵产虫草素供了一组最优的发酵配方，最佳配方为：信和酵母蛋白胨52.25 g/L、安琪酵母粉8.43 g/L、硫酸亚铁0.06 g/L、腺嘌呤3 g/L+甘氨酸12 g/L。在此条件下进行验证，测得虫草素产量6.35 g/L，与预测的产量相差2.25%。该发酵优化结果为后续放大发酵和应用研究奠定了基础。