刺鳅属(Mastacembelus)鱼类和中华刺鳅的线粒体COI基因序列比较

吴 斌，王海华*，曾庆祥，徐先栋，马本贺

(1.江西省水产科学研究所，江西 南昌 330039；2.赣州市水产科学研究所，江西 赣州 341000)

鲈形目(Perciformes)刺鳅科(Mastacembelidae)鱼类分布于非洲、东亚及南亚地区，其中刺鳅属(Mastacembelus)总共62个有效种[1-2]。分布于国内的刺鳅主要有5种，包括刺鳅属的4种，即大刺鳅(Mastacembelusarmatus)、腹纹刺鳅(Mastacembelusstrigiventus)、三叶刺鳅(Mastacembelustriolobus)、云斑刺鳅(Mastacembelusoatesii)，以及中华刺鳅属的中华刺鳅(Sinobdellasinensis)。其中，腹纹刺鳅、三叶刺鳅为2011年记述的2个新种，云斑刺鳅为新纪录种，三者在国内均只分布于云南省的部分地区。而大刺鳅主要分布于长江、珠江等流域，江西赣州定南县和信丰县等地具有一定的资源量。中华刺鳅则主要分布于国内东部地区，鄱阳湖地区也具有较广泛的分布[3-5]。鱼类亲缘关系的传统研究是基于形态分类学，刺鳅属鱼类的相关研究也局限于此。近年来，随着DNA序列信息的不断丰富，可以从分子水平上进行系统发生的研究。由细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COI)基因组成的DNA条形码因其具有标准的分类学研究、生物多样性研究、分子发育系统学研究等特点，目前已经被广泛运用于研究国内外鱼类分子系统发育、种群遗传和物种分化等方面[6-8]。本文通过研究线粒体的COI基因序列片段，初步分析了中华刺鳅与部分刺鳅属鱼类之间的系统进化关系，旨在了解刺鳅属鱼类之间的亲缘关系，并为刺鳅属鱼类资源保护、系统进化和杂交育种提供分子生物学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

刺鳅属在FishBase数据库中共有62个有效种，用拉丁名在GenBank数据库中搜索下载COI基因序列，得到27个有效种的COI基因序列，将其用于进行生物信息学分析的同时，为进一步明确中华刺鳅和刺鳅属的鱼类的关系，下载中华刺鳅的COI基因序列，以鲤作为外群构建分子系统发生树，用于本研究，共计29条序列，具体见表1。

表1 试验所选用鱼类的COI基因信息

1.2 数据分析

通过FasParser 2.10.0获得COI基因转录本最长(Open reading frame,ORF)开放阅读框序列，随后MEGA-X进行上述序列对齐。采用DAMBE 6.4软件对COI基因最长ORF序列进行饱和度检测，分别采用MEGA-X软件中的邻接法(Neighbour-Joining，NJ)、最大简约法(Maximum parsimony，MP)构建分子系统发生树。

2 结果与分析

2.1 COI基因碱基组成编码氨基酸及密码子使用分布概率

首先，计算刺鳅属鱼类27条序列的碱基组成，平均长度为670.5±24.8(602～688) bp。碱基组成：A总频率4696,占比25.9%；C总频率5272,占比29.1%；G总频率3119，占比17.2%；T总频率5013，占比27.7%；N总频率3，占比0%。A+T含量(53.6%)明显高于G+C含量(46.4%)。中华刺鳅COI基因中，A+T含量(57.8%)也明显高于G+C含量(42.2%)。最后，笔者还将27种刺鳅属鱼类COI基因部分序列编码20种氨基酸及密码子使用分布概率进行了分析，具体结果见表2。

表2 刺鳅属鱼类COI基因部分序列编码氨基酸及密码子使用情况

2.2 种间遗传距离

应用MEGA-X中Kimura双参数法计算刺鳅属鱼类、中华刺鳅以及鲤等29条COI基因序列的种间遗传距离，发现中华刺鳅(组别，1)与大多数刺鳅属鱼类均保持中等遗传距离(0.162～0.217)，但与非洲坦噶尼喀湖特有的Mastacembelusalbomaculatus(组别，11)的遗传距离较远，达到0.268，此外，中华刺鳅与鲤(组别，12)的遗传距离为0.299。进一步分析Mastacembelusalbomaculatus与其他刺鳅属鱼类的遗传距离，发现均保持较远的遗传距离(0.238～0.285)，Mastacembelusalbomaculatus与鲤的遗传距离为0.309。随后，还分析了大刺鳅(组别，2)与其他刺鳅属鱼类的遗传距离，发现与大多数刺鳅属鱼类均保持较近遗传距离(0.113～0.164)，但大刺鳅与Mastacembelusalbomaculatus的遗传距离为0.275，与中华刺鳅的遗传距离为0.168，与鲤的遗传距离为0.285，具体结果见表3。最后，笔者分别计算了27种和26种(剔除Mastacembelusalbomaculatus)刺鳅属鱼类的平均遗传距离，分别为0.134和0.123。

表3 29种鱼类的种间遗传距离

2.3 系统发育关系

采用DAMBE6.4软件对COI基因最长ORF序列进行饱和度检测，均满足条件双尾检测P<0.01，ISS

图1 基于COI部分序列片段NJ法构建系统发生树图2 基于COI部分序列片段MP法构建的系统发生树

3 讨论

刺鳅属鱼类和中华刺鳅的关系一直存在争论。1984年Travers将中华刺鳅归入鳗鳅科(Chaudhuriidae)。但Kottelat[9-10]和Britz[11]等一致认为中华刺鳅属于刺鳅科。Kottelat等[9-10]还通过形态学特征分析，为中华刺鳅独立建立了中华刺鳅属(Sinobdella)。在线粒体DNA序列中，D-Loop区由于进化速度相对较快，通常用于群体遗传学及近缘种间关系研究，12 S rRNA、16 S rRNA、COI基因序列等具有进化速率适中、容易扩增和排序、含有相对丰富的系统发育信息等优点，通常用于种属间至科级以下分类阶元系统发育分析研究[12-14]。不过，线粒体COI基因动物线粒体基因组有一个共性，即A、T、C、G等4种核苷酸在线粒体基因组中的分布存在差异性[15]。由于存在的选择压力和自然突变的差异，导致DNA分子上碱基的分布往往存在不均衡现象[16]，且密码子使用偏好模式与编码基因的GC含量有关[17]。因此，对该基因密码子使用偏好模式进行了研究，将有助于揭示这一生物遗传学现象在鱼类系统分类研究中的有效性。密码子偏好性在生物界中广泛存在，不同物种的基因密码子使用也存在较大差异[18]。由分析结果可见，在27种刺鳅属鱼类COI基因中，A+T含量(53.6%)明显高于G+C含量(46.4%)；在中华刺鳅COI基因中，A+T含量(57.8%)也明显高于G+C含量(42.2%)，这与大部分鱼类的COI基因序列研究的结果一致。通过对27种刺鳅属鱼类COI基因密码子使用偏好分析也发现，密码子3个位点的GC碱基含量亦存在分布不均衡现象，密码子使用偏好性是物种进化过程中基因突变和自然选择的结果，对物种起源和进化研究具有一定的意义[8]。

笔者通过系统收集目前能够获取的全部刺鳅属鱼类的COI基因序列，与中华刺鳅比较发现，中华刺鳅与刺鳅属鱼类的遗传距离确实相对较近，中华刺鳅与大多数刺鳅属鱼类均保持中等遗传距离(0.162～0.217)，略高于刺鳅属鱼类的平均遗传距离(0.123～0.134)，因此本研究结果支持中华刺鳅属于刺鳅科，同时建议重新整理刺鳅属。值得特别注意的是，非洲坦噶尼喀湖特有的Mastacembelusalbomaculatus与其他刺鳅属鱼类均保持较远的遗传距离(0.238～0.285)，与中华刺鳅的遗传距离也达到0.268。由NJ和MP法构建的系统发生树提示，非洲坦噶尼喀湖特有的Mastacembelusalbomaculatus是相对较古老的类群，刺鳅属鱼类可能起源于非洲，但由于本研究选取的物种类别及数量有限，另外使用一个线粒体基因往往有一定局限性，不能较好地解决鱼类的系统发生问题，需要进一步更加全面的分子生物学分析，收集更多种类的刺鳅属鱼类标本，并进行线粒体基因组测序，同时对关键物种进行全基因组测序。大刺鳅体型相对较大，作为江西赣州、福建龙岩等地的特色经济鱼类之一，其繁殖学的相关研究开展也较早，并已取得了人工繁殖的突破[19]，但中华刺鳅个体小、经济价值低。目前，其人工繁殖研究尚未见报道，但大刺鳅对养殖水体温度要求相对较高，而中华刺鳅对低温耐受能力相对较强，大刺鳅肌肉中的蛋白质含量高于草鱼和鲫鱼，与青鱼、泥鳅、鳗鲡、黄鳝等鱼类均值相近，而中华刺鳅的肌肉蛋白质含量高于大刺鳅[20-21]。本研究发现，大刺鳅与大多数刺鳅属鱼类均保持较近遗传距离(0.113～0.164)，但大刺鳅与Mastacembelusalbomaculatus的遗传距离为0.275，与中华刺鳅的遗传距离则只有0.168，因此，通过大刺鳅和中华刺鳅种间杂交，培育耐低温且营养高的新品种具有较大可行性。