梨树专用肥对翠冠梨树体营养水平及土壤微生物群落的影响

施春晖，王晓庆，张静增，李英丽，金风雷，张玉星，骆 军

(1.上海市农业科学院 林果果树研究所，上海 201403；2.上海市设施园艺重点实验室，上海 201403；3.河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071001；4.上海松江区梨树研究所，上海 201699)

中国是砂梨(PyruspyrifoliaNakai.)的起源中心，同时也是世界上砂梨资源最丰富的国家，近10年来，早熟砂梨在长江流域及长江以南地区快速发展。砂梨树体营养状况是决定果实优质、丰产的关键。

在传统砂梨生产中，种植者往往重视树体管理多于土壤管理，缺乏精准施肥的管理意识。事实上，根据具体树体的营养诊断结果制定科学合理的施肥方法才是有效改善树体营养状况的最佳途径[1]。20世纪70年代果实营养诊断的研究与应用起步，随着营养学科的不断发展，学者们提出了综合诊断法(Diagnosis and Recommendation Integrated System，DRIS)[2]，我国开展关于树体营养诊断的研究虽然起步较晚但发展迅猛，目前已建立了柑橘[3]、梨[4]、苹果[5]、芒果[6]等果树树种营养诊断标准，并在此基础上进一步对需肥次序做出诊断。王国英等[4]建立了黄冠梨营养诊断施肥标准，并提出了有针对性的优质配方肥。侯岑[7]建立了适于江苏、浙江、湖北、四川和福建这5省的翠冠梨叶片矿质营养诊断标准值。

目前，翠冠梨按需科学施配方肥方面的研究较少，未能充分发挥土壤营养水平对果实产量及品质的提升，也鲜见配方肥对土壤微生物环境研究的相关报道。本文以翠冠为研究对象，通过在果实发育期施用梨有机无机专用平衡肥，以常规施化肥为对照处理，研究了施肥对翠冠梨树产量及品质、土壤及梨叶片中营养水平、土壤微生物环境的影响，以期达到进一步按树体需求优化专用肥配方的目的，从根本上改变现阶段落后的施肥现状，为提高早熟砂梨果实品质、获得良好经济效益提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

施肥试验于2018～2020年在上海市崇明区庙镇鸽龙村进行，位于东经121°39′、北纬31°62′。崇明区属亚热带季风气候，年平均气温16.5 ℃，年平均降雨量1128.9 mm。果园排水通畅，土壤类型为砂质壤土，肥力中等。该地区是上海市梨产业发展的优势产区。

1.2 试验材料及设计

选园内树龄为12 a的盛果期翠冠品种为研究对象，树形为三主枝开心形，株行距 2.5 m×3.5 m；2018～2020年选择树体管理较为一致的树，每年采收前4周进行施肥处理，以单株为试验小区进行取样。选用由河北农业大学研制的梨有机无机专用平衡肥(Special balanced fertilizer， SBF)，在采收前4周按每50 kg果施入3 kg肥的量采用沟施方式一次性施入；对照施用常规复合肥(化肥)(Chemical fertilizer，CF)，生长季坐果后应施膨果肥，每株施三元复合肥(N-P2O5-K2O)0.5 kg；果实膨大期每株用高钾硫基复合肥(N-P2O5-K2O比例为14∶14 ∶30的水溶肥)0.1 kg 冲施。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的采集与处理 连续两年，每年6月底采集叶片，7月底到8月初采集果实测定品质及产量；春季前采集土样分析土样营养水平及微生物环境。叶片采集及处理参考王国英等[4]的方法。

土样采集及处理：于10月底采土。采取五点交叉取样法，于树冠垂直投影处，用土钻分别取0～20 cm和20～40 cm土层的土，每个样由同一土层的5个点组成，混合后用四分法留样2 kg左右。将其中50 g土放入50 mL离心管中，将离心管立即放入装有干冰的泡沫箱中保存，带回实验室放入-80 ℃冰箱保存，用于土壤微生物测序分析。每个样设8个重复。剩下的土壤放在挂有样品标签的塑料袋中，带回实验室摊开晾干，用榔头砸碎后过0.25 mm孔径的筛，保存于信封中，待测土壤pH值、EC值以及土壤大量、中量及微量元素。

果实取样及处理：在翠冠梨采收期，以单株为单位统计全树的结果量，统计单株产量，每个处理5个重复。单果重用电子天平称量，果实可溶性固形物用手持仪(ATAGO Master-20a，日本)测定。

1.3.2 样品测定 叶片元素测定参考王国英等[4]的方法。

土壤营养成分的测定参照王晓庆等[8]关于土壤pH值、电导率(EC)以及土壤中元素测定方法，其中土壤pH值、电导率(EC)分别利用电极法和电位法，有机质含量利用重铬酸钾容量法测定，碱解氮采用碱解-扩散吸收法测定，有效磷含量采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测定，速效钾含量利用乙酸铵提取-火焰光度法测定。

土壤微生物环境检测利用16S rDNA 测序，具体采用Nossa等的方法[9]。采用 DNA 抽提试剂盒对土壤样本的基因组 DNA 进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和浓度。以稀释后的基因组 DNA 为模板，根据16S V3～V4 区域，使用带 barcode 的特异引物343F(5’- TACGGRAGGCAGCAG -3’)和798R(5’- AGGGTATCTAATCCT-3’)，利用Takara Ex Taq高保真酶进行PCR。PCR产物使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后作为二轮PCR模板，并进行二轮PCR扩增，并再次使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后对PCR产物进行Qubit定量。根据PCR产物浓度进行等量混样，并上机测序(Agilent 2100 Bioanalyzer, USA)。下机后获得原始数据为FASTQ格式。使用Trimmomatic软件[10]对原始双端序列进行去杂。同时，利用UCHIME检测并去除序列中的嵌合体序列[11]。对测序数据进行预处理，生成优质序列之后，采用Vsearch软件[12]，根据序列的相似性，将序列归为多个OTU。序列相似度大于或等于97%被归为一个OTU单元。使用QIIME软件包[13]挑选出各个OTU的代表序列，并将所有代表序列与数据库进行比对注释。16S使用Greengenes或者Silva(version123)数据库比对，18S使用Silva(version123)数据库比对，物种比对注释使用RDP classifier软件[14]，保留置信区间大于0.7的注释结果。ITS使用Unite数据库比对。物种比对注释使用blast软件[15]。

1.4 数据处理

试验结果的数据表示为平均值±标准差(SD)。数据处理采用 Excel 2010 软件，显著性分析采用 SPSS 17．0 数据处理系统。

2 结果与分析

2.1 梨专用肥对果实品质及产量的影响

对经过3年SBF处理和对照CF处理的翠冠梨的果实产量及品质进行比较，由表1可知，SBF处理和CF处理在前两年对果实单果重的影响不显著，第3年SBF处理后果实单果重较CF处理显著提高了7.9%，平均单果重达402.65 g。虽然两种肥料处理对单株结果量的影响不显著，但由于SBF处理显著增加了单果重，使得SBF处理的产量达4811.14 kg/667 m2，与CF处理比较提高了23.45%，差异达极显著水平。在品质方面，与对照CF处理相比，SBF处理后的第一年即2018年果实的可溶性固形物含量便有极显著的提高，提高了0.97个百分点，平均可溶性固形物含量为12.12%；第2年和第3年SBF处理相比于CF处理，平均可溶性固形物含量分别提高了0.80和0.29个百分点，差异均达显著水平。

2.2 梨专用肥对树体营养水平的影响

2020年对持续3年进行SBF和CF肥料试验处理的梨树叶片进行营养元素的测定及分析， 6月底氮元素含量变化较为平稳，是测定氮元素含量的适宜采样时期，采集新梢中段成熟功能叶片，经测定后结果见表2。处理间梨叶片中常量元素N、K、Ca元素的含量存在显著差异，其中SBF处理叶片中的N元素含量显著高于CF处理的；SBF处理后叶片中的K元素含量比CF处理显著下降了0.04个百分点。处理间梨叶片中微量元素Zn、Fe、Mn、B的含量存在显著差异，其中SBF处理中Mn和Fe元素含量分别极显著、显著高于CF处理的，分别增加了38.91%和8.19%，而B元素则在CF处理的叶片中含量较高。

表2 不同肥料对梨叶片营养元素含量的影响

2.3 梨专用肥对梨园土壤理化性质及土壤养分的影响

通过对两种施肥处理的土壤营养水平进行测定，结果(图1)表明，处理间0～20 cm土壤pH值存在显著差异，SBF处理后的土壤pH值为7.10，CF处理后的土壤pH值为7.42；在20～40 cm土层中SBF处理的土壤pH值也低于CF处理的，但差异不显著。土壤中性略微偏碱，略高于南方梨pH适宜值5.8～7.0[17]。土壤有机质含量被视为最重要土壤肥力指标。0～20 cm土层的土壤有机质含量经SBF处理后较对照CF显著提高，达3.05%，较CF土壤有机质含量高8.54%。土壤水解性氮或称碱解氮(有效氮)能反映土壤近期内氮素供应情况，包括无机态氮(铵态氮、硝态氮)及易水解的有机态氮(氨基酸、酰铵和易水解蛋白质)。在0～20 cm土层中，经SBF处理的有效氮含量显著低于CF处理的，达11.17%； 在20～40 cm土层中，经SBF处理的有效氮含量比CF处理显著降低28.57%。而20～40 cm土层中经SBF处理的土壤有效磷含量较对照CF处理增高了21.26%。速效钾含量的差异主要存在于20～40 cm的土层中，其中CF的速效钾含量是SBF处理的2.39倍。

图1 不同肥料对梨园土壤营养水平的影响

2.4 梨专用肥对梨园土壤微生物菌群的影响

2.4.1 梨专用肥处理土壤细菌属水平主要物种丰度及多样性指数 通过16S rDNA基因高通量测序分析结果(图2)表明，两个施肥处理后土壤样品的稀释曲线逐渐趋于平缓，表明取样合理，测序片段读取基本饱和，并且两个处理的取样，具有很强的代表性。由表3可知，两个施肥处理的土壤微生物多样性指数存在显著性差异，SBF和CF处理的土壤微生物平均OTU分别为4123和3897，两者差异显著。SBF处理的Chao1、ACE参数显著高于CF，表明SBF处理土壤的微生物群落多样性增加。

表3 不同肥料处理的土壤微生物多样性指数

2.4.2 梨专用肥处理对土壤微生物多样性的影响 根据土壤处理样本SBF和CF微生物群落主要物种注释及丰度数据分析，微生物群落在门水平上丰度最高的4个门分别为变形细菌(57.64%)、芽孢杆菌(8.73%)、放线菌(8.16%)、酸菌(7.74%)。选取丰度排名前30位的属进行比较(图3)，在属水平上(相对丰度大于1%)，两个肥料处理后的土壤优势菌以 MND1慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、罗河杆菌属(Rhodanobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)为主。SBF处理与CF处理相比，拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、马杜拉放线菌属 (Actinomadura)、竹杆菌属(Chujaibacter)相对丰度较高，而硝化螺菌(Nitrospira)在CF处理的土壤中相对丰度较高(图3)。土壤中Gaiella菌的相对丰度与土壤有机质、有效氮、有效磷、速效钾含量呈显著负相关，与电导率EC值成反比；纤维弧菌属(Cellvibrio)的相对丰度与土壤有机质、有效氮、有效磷、速效钾含量呈显著正相关。

图2 不同肥料处理下对土壤样品的16S rRNA稀释曲线

A：MND1罗丹杆菌拟杆菌；B：罗河杆菌Rhodanobacter；C：硝化螺菌Nitrospira；D：竹杆菌Chujaibacter；E：拟杆菌属Bacteroides；F：海洋粘细菌Haliangium；G：马杜拉放线菌 Actinomadura；H：双歧杆菌Bifidobacterium；I：mle1-7；J：Subgroup_10；K：鞘氨醇单胞菌Sphingomonas；L：黄类固醇杆菌 Steroidobacter；M：运动东菌Dongia；N：芽孢杆菌 Gemmatimonas；O：黄杆菌Flavobacterium；P：瘤胃球菌Ruminococcus_2；Q：活泼瘤胃球菌[Ruminococcus] _gnavus_group；L：JdFR-76；S：大肠埃希氏菌 Escherichia-Shigella；T：黄色单胞菌 Luteimonas；U：IS-44；V：放线菌Gaiella；W： Chryseolinea；X：Pseudolabrys；Y：不粘柄菌 Pseudolabrys；Z： 严格梭菌 Clostridium_sensu_stricto_1；A1： 生丝微 Hyphomicrobium；B1：分枝杆菌 Mycobacterium；C1：酸杆菌 Acidibacter；D1：地杆菌 Geobacter。

3 讨论

梨树属于多年生木本植物，生长周期长，通过营养诊断技术发现，在各生长周期梨树各部位中的矿质营养表现出不同的需肥特点，花后到果实成熟生殖生长阶段对元素的需求量增加，种植者需要根据需肥规律通过追肥为根系输送矿质营养。长期不同的施肥措施会影响土壤养分水平和土壤微生物群落的多样性[19]。果树专用肥既具备了无机肥的快速高效性，也具备了有机肥的长效性，能有效提高果实的产量及品质。河北农大根据梨树、苹果树的需肥特点、梨优质丰产叶片营养标准值以及果园营养水平研制了富含梨树必需营养元素及腐殖质的平衡专用肥，并且在黄冠上施用专用肥后土壤有机质含量比传统施入化肥有显著的提高[1，4]。张超等[19]研究发现苹果专用肥显著提高了土壤有机质的含量以及微生物群落功能的多样性。在本研究中，梨专用平衡肥的施用对梨园土壤有机质、土壤有效养分及土壤微生物菌群均有不同程度的提高，与上述的研究结果一致。SBF处理和CF处理后在0～20 cm土层有效氮和速效钾含量差异不显著，但其含量在20～40 cm土层化肥CF处理的显著高于SBF处理的，究其原因可能是化肥短期提高土壤有效养分含量的能力要强于有机肥，以有机肥为主的专用肥虽然肥效较为缓慢，但可有效降低土壤酸碱度，抑制土壤盐碱化，同时有效提高土壤有机质含量，平均有机质含量达3.05%。黄春辉[20-21]等研究表明土壤有机质含量和可溶性固形物含量之间呈正相关的关系，有机质为土壤提供植物所需的单糖类、氨基酸和维生素等小分子有机物，可有效提升果实的风味，是保证果树基础产量及品质的关键。

目前，福建、江苏、浙江制定了高产翠冠梨叶片营养诊断标准值[7, 22]，而上海地区还未见翠冠梨叶片营养诊断标准值的报道。本研究发现叶片中氮含量略低于浙江、江苏两地的，但经过施用有机无机专用肥后叶片中的氮含量为2.21%，与常规施化肥的相比有显著的升高，并且与土壤中的氮含量无显著相关性，该结果与王晓庆等[9]在同一地区测定的翠冠梨叶片氮含量值相近，并且上海不同地区叶片氮含量值差异明显，推测这可能与上海地区土壤类型差异相关。SBF处理后的叶片中常量元素Ca、Mg和微量元素Zn、Fe、Mn的含量均比常规化肥CF处理的高，除Fe元素含量偏低以外，其他元素含量均符合高产园翠冠叶片元素标准，可见梨专用肥基本满足翠冠梨需肥要求，能较为平衡地为树体提供针对性的营养。

果树有机无机专用肥不仅改善了土壤理化性质和土壤养分，还进一步改善了土壤的微生物群落结构。本研究中SBF专用肥处理显著提高了果园土壤有机质含量，同时该处理的土壤微生物OTU、Chao1、Shannon 指数均高于CF无机肥处理的，提高了土壤微生物群落多样性，这与邵丽[21，23-24]等的研究结果基本一致。本研究中梨有机无机专用平衡肥处理的土壤中Gaiella菌的相对丰度下降，Spearman相关性分析结果表明Gaiella菌与有效氮含量呈负相关关系(表4)。研究表明土壤中硝态氮N-NO3含量上升的土壤中Gaiella菌群数量会降低[25]，这与电导率EC值成反比。梨专用肥料处理中纤维弧菌属(Cellvibrio)的相对丰度与土壤有机质、有效氮、有效磷、速效钾含量呈显著正相关，其作为促进植物高效腐解的优势菌，能通过促进土壤中的碳源快速分解而提高土壤的有机质及其他矿物质的含量[26]。总之，梨有机无机专用肥可以在一定程度上提高梨园土壤的有机质含量，提高土壤中菌群数量，为有效提高梨树果实产量及品质提供均衡的营养。

表4 土壤元素与土壤细菌数相关性分析