高压脉冲电场处理普洱熟茶对大鼠体内抗氧化活性的影响

冷 彦，赵 艳，王 静，沈晓静，陈立佼，陈亚平，杨贺凯，王白娟*

(1.云南农业大学，云南 昆明 650201；2.云南省有机茶产业智能工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南省高校智能有机茶园建设重点实验室，云南 昆明 650201)

2008年发布的地理标志产品普洱茶国家标准GB/T 22111─2008中将普洱茶定义为“以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青茶为原料，并在地理标志保护范围内采用特定的加工工艺制成，具有独特品质特征的茶叶”[1]。普洱茶具有降血脂、降血糖、抗衰老、美容减肥以及神经保护功能等多种保健功效[2-3]。高压脉冲电场(high voltage pulsed electric field，HPEF)技术是一种应用于食品工业的非热处理技术，具有处理时间短、无污染和能耗低等特点，被普遍应用于农产品加工、食品杀菌和保鲜以及天然产物的提取等领域[4]。

有学者针对HPEF对普洱茶中细菌、内含物及香气的影响做了一系列的研究，结果表明，适当的HPEF条件可以显著降低普洱茶中的细菌总数[5]，明显提高普洱茶茶水浸出物含量[6]，降低总灰分含量[7]，降低咖啡碱含量[8]，提高氨基酸含量[9]，提高香气主要成分含量[10-11]，促进普洱熟茶中茶多糖的转化[12]，提高普洱熟茶的体外抗氧化活性。自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，会损害机体的组织和细胞，引起慢性疾病及衰老[13]。生物体内存在清除自由基的酶系，如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)等。该酶系可通过氧化还原反应将自由基氧化，而抗氧化酶的活力会随机体年龄增加而减弱[14]。因此，为了进一步探究HPEF处理技术对普洱茶的作用机理，本文利用HPEF处理后的普洱熟茶，进行动物实验，通过测定大鼠体内不同脏器的抗氧化活性指标，分析了HPEF处理对普洱熟茶体内抗氧化功效的影响，从而评估了HPEF处理普洱熟茶对大鼠体内抗氧化活性的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

云南临沧三级普洱熟茶散茶，购自云南福茶茶叶有限公司；茶褐素，购自云南十草木生物科技有限公司(纯度≥0.7 g/g)；健康SPF级雌性SD大鼠，购自昆明楚商科技有限公司，体质量(245±20)g。南京建成生物工程研究所生产的GSH-Px、CAT、抑制羟自由基以及MDA测定试剂盒。

DMC-200型高压脉冲电源及处理箱(大连鼎通科技发展有限公司)。处理箱为五面密封的有机玻璃处理箱(长71 cm×宽41 cm×高41 cm)。高压脉冲电源主要参数如下：输出电压：0～69 kV；输入电压：AC 220 V±22 V；输出脉冲占空比：0～70%；输出脉冲频率：50 Hz～2000 Hz；输出功率：2000 W。

1.2 实验方法

1.2.1 HPEF参数的确定 本研究参数确定参考王白娟等[12]的研究结果，设置时间为55 min，频率为80、99、121、139和162 Hz，电压在12～22 kV范围内，通过单因素实验组成55组(表1)。每组茶样称取300 g，将经HPEF处理的茶样装入自封袋中并做好相应的标记。按照国家标准《茶叶感官审评方法》(GB/T 23776─2009)中的审评方法制备待检茶汤，进行HPEF处理茶样的感官审评[15]。感官审评结果为：第45组(HPEF：12 kV/162 Hz/55 min)的感官品质最好，收敛性最好。因此，进行动物实验时选择12 kV/162 Hz/55 min作为HPEF预处理条件。

表1 HPEF电压、频率的设置

1.2.2 速溶茶粉的制备 本研究采用真空冷冻干燥技术制备茶粉，分别取未处理的普洱茶和经过HPEF处理的普洱茶1 kg，用沸水浸提3次(各次茶水比为1∶20、1∶20、1∶10)，浸提时间分别为10、20、25 min，合并3次浸提液，放入真空冷冻干燥箱中进行干燥，待冰晶完全消失后，将干燥后的茶粉刮下，并放入自封袋中密封保存，茶粉的得率约为25%。

1.2.3 动物实验的组别设计 根据日本东京桑野研究推荐成人每日平均用茶量6 g，我国男女总平均体重60 kg，则成人每日用茶量为每千克体重0.1 g[16-17]。根据《保健食品功能评价》要求，本实验按人体推荐量的5倍作为SD大鼠的最低剂量，中、高剂量分别为人体推荐量的10倍和20倍，即高、中、低剂量组分别给予普洱熟茶2.0、1.0、0.5 g/kg。

取大鼠160只，按体重随机分为8组，每组20只，分别设置：处理组1：HPEF预处理高剂量组(2.0 g/kg BW)；处理组2：HPEF预处理中剂量组(1.0 g/kg BW)；处理组3：HPEF预处理低剂量组(0.5 g/kg BW)；处理组4：未预处理普洱熟茶高剂量组(2.0 g/kg BW)；处理组5：未预处理普洱熟茶中剂量组(1.0 g/kg BW)；处理组6：未预处理普洱熟茶低剂量组(0.5 g/kg BW)；处理组7：空白对照，饲喂清水；处理组8：阳性(茶褐素)对照组(1.0 g/kg BW)。

小鼠适应1周后，采用灌胃给药，空白组的大鼠灌胃用相当量的饮用水，灌胃时间为17∶00～19∶00。根据《保健食品检验与评价技术指南》，设受试样品给予最短时间为4周;由于实验条件的限制，设置8周为受试样品最长时间。灌胃4周和8周后，分别检测各组大鼠血清和肝、肾、心、脑中GSH-Px活力、CAT活力、抑制羟自由基能力以及MDA含量。

1.2.4 血清中抗氧化指标的测定 对大鼠股动脉进行采血，先将采集到的血液放入离心管中静置0.5 h，再进行离心处理。离心机转速为3000 r/min，离心时间为15 min。接着用移液管吸取上层清液，移入预先标好的离心管(容量为5 mL)中，采用南京建成生物工程研究所生产的GSH-Px、CAT、抑制羟自由基以及MDA测定试剂盒来对其进行指标测定。

1.2.5 组织中抗氧化指标的测定 解剖时观察组织有无病变，摘取大鼠肝脏组织右叶，摘取大鼠左右肾脏并将血管和外膜去除，摘取大鼠心脏并去除血管与血液，摘取大鼠的脑组织。将各组织分别放入0.9%生理盐水中漂洗，捞出，放在吸水纸上吸净水分并称其总重量，然后放入容量为50 mL的空烧杯中，并将大块的组织迅速剪碎。向烧杯中准确移取组织重量3倍的0.9%的生理盐水，置于冷水中进行冷水浴，在冷水浴条件下机械匀浆，得到10%的组织匀浆。设置离心机的转速为3000 r/min、离心时间为15 min，将组织匀浆放入离心机中进行离心，离心完成后吸取上层清液，按照南京建成生物工程研究所生产的GSH-Px、CAT、抑制羟自由基以及MDA测定试剂盒来对其进行指标测定。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 各处理组对大鼠血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中GSH-Px活力的影响

由图1可知，相对于空白组，血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中HPEF处理组和普洱茶组均较好地提高了GSH-Px活力，且在心脏组织中HPEF高剂量组灌胃8周后差异性最显著，GSH-Px活力提高了49.90%达到了极显著水平(P<0.01)。在相同剂量组条件下，相对于普洱茶组，HPEF处理组较好地提高了血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中GSH-Px活力，且在心脏组织中HPEF低剂量组灌胃8周后差异性最显著，GSH-Px活力提高了18.13%，达到了极显著水平(P<0.01)。相对于灌胃第4周，灌胃第8周后在血清样本、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中GSH-Px活力均提高了，且在血清中HPEF中剂量组提高作用最明显，GSH-Px活力增加了0.12%。结果表明，HPEF处理具有显著增加GSH-Px活力的作用，其中，高剂量组较空白组影响更显著(P<0.01)。在同一剂量水平下观察时间效应，发现HPEF各剂量组GSH-Px活力随时间的增加也呈现动态增加。

“*”和“**”分别表示各处理组与处理组7比较在P<0.05和P<0.01水平上的差异显著性；“#”和“##”分别表示在同剂量条件下，各处理组在P<0.05和P<0.01水平上的差异性。下同。

2.2 各处理组对大鼠血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中CAT活力的影响

由图2可知，相对于空白组，血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中HPEF处理组和普洱茶组均较好地提高了CAT活力，且在心脏组织中HPEF高剂量组灌胃8周后差异性最显著，CAT活力提高了261.13%，达到了极显著水平(P<0.01)。在相同剂量组条件下，相对于普洱茶组，HPEF处理组均较好地提高了CAT活力，且在肝脏组织中HPEF中剂量组灌胃4周后差异性最显著，CAT活力提高了26.79%，达到了极显著水平(P<0.01)。相对于灌胃第4周，灌胃第8周后在血清样本、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中CAT活力均提高了，且在血清中HPEF中剂量组提高作用最明显，CAT活力增加了1.95%。结果表明，HPEF处理具有显著增加CAT活力的作用，其中，血清、肾脏、心脏和脑组织中高剂量组较空白组影响更显著(P<0.01)，而肝脏组织中中剂量组影响更显著，说明肝脏组织中中剂量组的HPEF处理组能更好地提高CAT活力。

2.3 各处理组对大鼠血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中抑制羟自由基能力的影响

由图3可知，相对于空白组，血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中HPEF处理组和普洱茶组均较好地提高了抑制羟自由基能力，且在肝脏组织中HPEF高剂量组灌胃8周后差异性最显著，抑制羟自由基能力提高了90.80%，达到了极显著水平(P<0.01)。在相同剂量组条件下，相对于普洱茶组，HPEF处理组较好地提高了血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中抑制羟自由基能力，且在心脏组织中HPEF低剂量组灌胃8周后差异性最显著，抑制羟自由基能力提高了121.20%，达到了极显著水平(P<0.01)。相对于灌胃第4周，灌胃第8周后在血清样本、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中均提高了抑制羟自由基能力，且在肝脏组织中HPEF低剂量组促进作用最明显，抑制羟自由基能力增加了0.18%。结果表明，HPEF处理具有显著增加抑制羟自由基能力的作用，其中肝脏组织和心脏组织中低剂量组较空白组影响更显著(P<0.01)，肾脏组织和脑组织中高剂量组较空白组影响更显著(P< 0.01)。

2.4 各处理组对大鼠血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中MDA含量的影响

由图4可知，相对于空白组，血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中HPEF处理组和普洱茶组均较好地降低了MDA含量，且在肾脏组织中HPEF高剂量组灌胃8周后差异性最显著，MDA含量降低了27.78%，达到了极显著水平(P<0.01)。在相同剂量组条件下，相对于普洱茶组HPEF处理组较好地降低了血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中MDA含量，且在心脏组织中HPEF低剂量组灌胃8周后差异性最显著，MDA含量降低了14.70%，达到了极显著水平(P<0.01)。相对于灌胃第4周，灌胃第8周后在血清样本、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中MDA含量均降低了，且在肝脏组织中普洱茶低剂量组降低作用最明显，MDA含量降低了0.1%。结果表明，HPEF处理具有显著降低MDA含量的作用，其中，高剂量组较空白组影响更显著(P<0.01)。在同一剂量水平下观察时间效应，发现HPEF各剂量组MDA含量随时间的增加也呈现动态减少。

3 讨论与结论

机体内存在着酶和非酶抗氧化防御系统，包括GSH-Px、CAT、抑制羟自由基和MDA等。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，能够清除自由基，从而降低组织的氧化损伤[18]。CAT是过氧化物酶体的标志酶，是机体内有效的过氧化氢清除剂[19]。羟自由基具有极强的得电子能力也就是氧化能力，抑制羟自由基能力是评价抗氧化活性的指标之一。MDA是评判脂质过氧化的指标，其含量与细胞损伤程度呈正相关[20]。

本文采用HPEF处理普洱熟茶，喂食SD大鼠后，对血清、肝、肾、心脏和脑中的GSH-Px活力、CAT活力、抑制羟自由基能力和MDA含量进行检测，评价HPEF处理后的普洱熟茶抗氧化能力。大鼠灌胃高、中、低剂量组的HPEF处理组和普洱茶组均能够提高血清中GSH-Px、CAT活力和抑制羟自由基能力，并能有效降低MDA含量，表明普洱熟茶具有抗氧化作用，这与侯艳等[21]的研究结果一致。在同一剂量条件下普洱熟茶在经过HPEF处理后，其各项指标均优于普洱茶组，即其抗氧化活性增强；同时抗氧化指标在大鼠血清、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织和脑组织中表现出不同的差异性，即在不同的组织中，抗氧化功能具有差异性。推测是由于血清和各组织中GSH-Px活力、CAT活力、抑制羟自由基能力和MDA含量不同。推测由于高压脉冲电场可以提高茶多酚的转化率，促进其抗氧化能力的增强[22-23]。

综上所述，在一定时间内，HPEF可以增强机体内GSH-Px活力、CAT活力和抑制羟自由基能力，降低脂质过氧化物MDA含量，从而防御生物体内氧化损伤，增强体内抗氧化功能。HPEF为普洱茶抗氧化产品的开发利用提供了新思路，对提高普洱熟茶的抗氧化性具有重要的意义，其潜在的应用价值有待进一步深入研究。