氧化再生纤维素壳聚糖复合物止血海绵的制备及性能研究

黄治曙，周立新，苏继钦，严辉弟，林艳丽

1.厦门医学院附属第二医院肝胆外科，福建 厦门 361021；2.厦门医学院附属第二医院病理科，福建 厦门 361021

出血是战伤、外科手术和日常意外事故中常常遇到的问题，甚至危及人们的生命。因此，如何有效的止血、研究和选择快速、有效的止血材料一直是个重要课题。目前临床常用的可吸收止血材料主要为纤维素类、明胶蛋白、明胶类、淀粉类、壳聚糖。近年，壳聚糖作为止血材料因具有良好的生物相容性、高透气和高亲水性、抑菌抗炎和促进伤口愈合等特点而成为研究热点［1］；氧化再生纤维素是近年广泛用于临床的一种止血材料，来源广泛，止血效果良好，体内完全降解，但水溶性较差、止血机制单一。如能将氧化再生纤维素与壳聚糖相结合制成复合物，既增加氧化再生纤维素水溶性、完善止血机制以提高止血效果，又兼壳聚糖之良好抑菌、抗炎、促进组织愈合作用，可能对临床及外伤止血更有意义。本实验以壳聚糖为基础，制备氧化再生纤维素-壳聚糖基复合物（oxidized regenerated cellulose/chitosan complex，ORC-CTS），并研究其理化性质、止血功能、生物安全性，以期达到迅速吸血、快速止血、降低感染的目的。

1 材料及方法

1.1 实验材料和仪器

1.1.1 主要仪器

磁力搅拌器：德国IKA仪器有限公司；冷冻离心机：德国HERMLE公司；循环水真空泵：郑州长城科工贸有限公司；分析天平：北京赛多利斯仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪：美国热电有限公司；热重分析仪：德国耐驰仪器有限公司；酸度计：德国赛多利斯仪器有限公司。

1.1.2 试剂

再生纤维素：保定天鹅新型制造有限公司（DP=320）；壳聚糖：上海麦克林试剂有限公司（黏度<200 mPa）；次氯酸钠：上海国药试剂有限公司；溴化钠：上海国药试剂有限公司；2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基自由基（TEMPO）：上海麦克林试剂有限公司；溴化钾：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰醋酸：上海国药试剂有限公司；透析袋：北京索莱宝科技有限公司（透析分子量3 500 D）；氢氧化钠：上海国药试剂有限公司；乙醇：上海国药试剂有限公司。

1.1.3 材料

SD大鼠：上海杰斯捷动物实验有限公司；速即纱：美国强生公司；复合微孔多聚糖止血粉：山东塞克赛斯药业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 氧化再生纤维素合成

将氧化再生纤维素样品（4 g）分散在水（190 mL）、NaBr（0.20 g）和TEMPO（0.02 g）溶液中，在磁力搅拌下加入12%NaCl O溶液（18 mL）开始反应；用pH值计测定保持pH值10～10.5，并用2%NaOH液进行调节。反应32 h后，加入5 mL乙醇溶液终止反应。10000 r/min离心10 min，收集沉淀，再加入去离子水洗涤至中性。取氧化的再生纤维素（2.0 g）加入100 mL水，用高速分散器在13 000 r/min下分散5 min，10 000 r/min离心10 min后收集沉淀，冷冻干燥24 h后变为氧化再生纤维素冻干粉。

1.2.2 氧化再生纤维素负载壳聚糖

将壳聚糖溶解在1%醋酸溶液中得到0.5%壳聚糖溶液。将1 g氧化再生纤维素加入到200 mL壳聚糖溶液中，室温下磁力搅拌6 h，10 000 r/min离心10 min后取沉淀，去离子水洗涤6次，最后将洗涤干净的负载壳聚糖的氧化再生纤维素冷冻干燥24 h。

1.2.3 表征

以傅立叶红外光谱仪（美国热电有限公司）检测氧化再生纤维素壳聚糖复合物复合前后化学变化。

1.2.4 体内止血实验和毒性分析

（1）肝脏渗血创面模型和股动脉出血模型制作和止血实验

随机选取80只SD大鼠，分别制作肝脏渗血创面模型和股动脉出血模型，每个模型分以下4组，每组10只大鼠。肝脏渗血创面模型：采用屋顶样切口进腹，逐层进入腹腔，显露并切除部分左叶，形成长20 mm、深2 mm出血（3 s）创面。股动脉出血模型：在大鼠一侧腹股沟游离解剖出股动脉，用尖头刀挑破、完全横断股动脉，使其出血3 s。然后，分别应用相同质量（100 mg）的氧化再生纤维素/壳聚糖复合物（ORC-CTS，ORC-CTS组）、壳聚糖（壳聚糖组）、速即纱（速即纱组）止血，其中1组大鼠仅加压止血，不用任何止血材料（即空白对照组）。观察各组的出血量和止血时间。

（2）毒性分析

采集大鼠止血后缺损处的肝组织和24、72、168 h血清，HE染色观察肝组织生长，分析血清TNF、异前列腺素和血管性血友病因子（vWF）含量变化，以评价各组预后及对应用材料的毒性反应。

2 实验结果

2.1 表征

图1为氧化再生纤维素改性壳聚糖的傅立叶红外光谱图（FT-IR）。3430 cm-1附近宽而强的吸收峰是-OH的伸缩振动峰，2 875 cm-1附近吸收峰是C-H的伸缩振动峰，1 070 cm-1附近吸收峰是葡萄糖单元-O-的吸收峰。在1 634 cm-1附近的峰强出现不同程度增加，该峰对应为酞胺基团，表明壳聚糖的-NH2和ORC上的-COOH发生了化学反应。

图1 氧化再生纤维素改性壳聚糖红外光图谱Fig.1 Infrared spectra of chitosan modified by oxidized regenerated cellulose

2.2 体内止血效果比较

在SD大鼠肝脏创面出血模型，ORC-CTS组的纱布吸血量即出血量（1.339±0.072）g明显少于壳聚糖［（2.148±0.152）g，P<0.05］、速 即 纱［（1.621±0.075）g，P<0.05］及空白对照组［（2.605±0.067）g，P<0.05］；ORC-CTS组的止血时间（67.700±3.401）s明显短于壳聚糖组［（120.000±1.155）s，P<0.05］、速即纱组［（90.300±2.791）s，P<0.05］、空白对照组［（135.500±2.173）s，P<0.05）］（表1）。表明ORCCTS能减少大鼠肝创面出血的出血量并缩短止血时间。而且，在SD大鼠股动脉横断出血模型，ORCCTS组的纱布吸血量即出血量（1.242±0.088）g亦明显少于壳聚糖组［（1.816±0.052）g，P<0.05］、速即纱组［（1.437±0.503）g，P<0.05］、空白对照组［（2.092±0.103）g，P<0.05］；止血时间（47.300±3.592）s亦明显短于壳聚糖组［（89.000±2.828）s，P<0.05］、速即纱 组［（68.100±3.107）s，P<0.05］、空 白 对 照 组［（105.500±2.173）s，P<0.05］（表2）。表明，ORCCTS能减少大鼠股动脉出血的出血量并缩短止血时间。总之，相较壳聚糖、速即纱，ORC-CTS能减少大鼠模型的出血量，缩短止血时间。

表1 各组SD大鼠肝脏创面止血效果Tab.1 The hemostatic effect of liver wounds in SD rats in four groups

表2 各组SD大鼠股动脉出血止血效果Tab.2 The hemostatic effect of femoral artery hemorrhage in SD rats in four groups

2.3 体内炎症反应及毒性比较

本实验通过采集SD大鼠术后1、3、7 d肝脏模型缺损处肝组织行HE染色观察肝创面坏死区域面积及炎症细胞浸润程度以评价各组生物体内炎症反应。图2为术后1、3、7 d，各组肝创面均可见少量变性坏死，汇管区局灶淋巴细胞及少量中性粒细胞浸润，术后第7天较第1、3天炎性细胞较多；炎症程度依次对照组

图2 肝创面止血术后1、3、7 d缺损处肝组织HE染色Fig.2 HE staining of liver tissues 1，3，and 7 days after liver wound hemostasis

本实验还采集肝脏创面模型SD大鼠术后1、3、7 d血清，通过分析血清TNF-α（炎症指标）、异前列腺素（氧分指标压）和vWF含量变化，以评价各组的体内毒性反应。图3为ORC-CTS组血清三种蛋白变化与对照组无差异。表明，ORC-CTS几无体内毒性。

图3 大鼠肝创面止血后1、3、7 d血清TNF-α、异前列腺素、vWF含量变化即体内毒性反应Fig.3 Serum TNF-α，isoprostanes，and v WF levels 1，3，and 7 days after liver wound hemostasis（i n vivo toxicity）

3 讨论

壳聚糖，也称甲壳胺，是甲壳素的脱乙酰基衍生物，因其在自然界中来源广泛、无毒、可自然降解，且具良好的抗菌、强吸附和吸湿保水、生物相容性［2］，故和其衍生物广泛运用于吸附材料、过滤材料、保湿剂、食品保鲜剂等领域；还因具有抗菌、消炎、止血、减少创面渗液和促进创面再生、修复、愈合［3］，广泛用作医用材料或与其他材料复合制备止血材料、创面敷料、人工支架，也可用作医用材料改性剂及药物缓释剂［4］。有报道，壳聚糖可以薄膜、海绵、水溶胶等形态与其他具有治疗价值的高分子聚合物材料如纳米银、海藻酸盐等形成复合型壳聚糖敷料，用于不同部位的伤口治疗；应用壳聚糖改性人工韧带，改善其性能［5］，或改性长丝聚乳酸，以获断裂强度适中、表面光滑、可减少缝合疼痛的壳聚糖改性手术缝线［6］；关节内注射壳聚糖治疗膝骨关节炎［7］。在止血材料领域，已有报道壳聚糖丝素蛋白多孔复合物［8］、壳聚糖/明胶海绵复合物［9］、壳聚糖/海藻酸盐复合物［10］、介孔硅/壳聚糖复合物［11］等相关研究，但壳聚糖/氧化再生纤维素复合物用作止血材料则鲜有报道。

壳聚糖的止血机制主要包括以下方面：（1）壳聚糖表面正电荷与红细胞带负电荷的胞壁酸结合，产生静电中和反应，发生凝集，快速形成血凝块止血；（2）壳聚糖表面正电荷可与活化血小板表面负电荷中和，通过ADP途径对血小板起聚集作用，且聚集后产物能释放更多活性物质如P-选择素（Pselectin）、血栓素B2（TXB2）等，激活周围血小板、促进血管收缩和纤维蛋白形成等，加强止血效果；（3）壳聚糖本身分子结构与血浆蛋白、凝血因子相互反应，使血凝块更牢固［12］。氧化再生纤维素是通过与血液接触后形成凝胶状物质，形成物理屏障，同时压迫出血点；其中一定量的酸性梭基能吸附血液Fe3+，形成棕色凝胶状物质，既能封闭血管末端，形成物理止血，还能吸附、聚集、激活血小板，加速血液凝固［13-14］。本实验通过氧化再生纤维素负载壳聚糖制备ORC-CTS，使两者凝血机制相互协同，故增强了止血效果。体内止血实验亦表明，ORC-CTS能显著减少出血量，缩短出血时间；且生物体内炎症反应轻，拥有良好的体内生物相容性，在生物体内几乎无毒。因此，本研究制备的ORC-CTS是一种较理想的新型止血材料。如能进一步研究并氧化再生纤维素负载不同分子量的壳聚糖，选出止血效果最佳复合物，并完善复合物的抑菌、促进伤口愈合等作用，将有助于成为新一代的高效、安全的止血材料。