检测ClO-的近红外荧光探针的合成及细胞成像

王光跃， 张淑平

（上海理工大学，上海 200093）

次氯酸盐（ClO）是生物体内最重要的活性氧物种之一[1-2]。在生物体内，ClO-由髓过氧化物酶(MPO)催化的活化中性粒细胞中的过氧化氢和氯离子生成[3-4]。次氯酸盐的生产过量会导致组织损伤和一系列人类疾病，如动脉粥样硬化、关节炎甚至癌症等[5-6]。因此，快速、灵敏的检测ClO-在生物体中相当重要。

到目前为止，已经报道了许多检测ClO-的方法，例如生物发光法[7]、比色分析法[8]、电化学分析法[9]、辐射法[10]、荧光法[11-13]等等。其中，荧光法具有较好的灵敏度和选择性。分子荧光探针因其特点，可用作生物系统中跟踪生物分子的有力工具[14]。小分子荧光探针具有成本低、毒性小等优点，已经逐渐成为生物及医学领域的主要研究方法[15-20]。近年来，已有多个科研团队开发了多个荧光探针，并实现了良好的生物应用[21-23]。而这些已开发出的荧光探针分子，大多具有较短的发射波长（＜650 nm），成像时会被生物样品自身荧光信号所干扰，导致较差的灵敏性，从而不能准确地进行细胞内物种检测。

本文基于亚甲蓝荧光团化学结构的逆向分析，首次合成出了化合物MB-nBu，并考察了化合物MB-nBu与ClO-反应的光谱变化及稳定性。另外，在进行了化合物MB-nBu的细胞毒性探究实验后，对化合物MB-nBu的生物适用性进行了探究。

1 实验

1.1 试剂和仪器

实验药品试剂如表1所示，实验仪器如表2所示。

表1 实验药品试剂

表2 实验仪器

1.2 探针MB-nBu的制备

探针MB-nBu的合成步骤，根据文献[23-24]，做少量调整（如图1所示）：

图1 探针MB-nBu的合成

1）将亚甲基蓝MB（1 mmol，384 mg）、碳酸钠（4 mmol，424 mg）6 mL水和9 mL二氯甲烷混合，并在40℃搅拌，氮气保护下注射加入连二亚硫酸钠（4 mmol，696 mg），搅拌反应30分钟，得到化合物1；

2）向溶液中加入碳酸钠（424 mg，4 mmol），置于冰浴中、氮气保护，逐滴加入三光气（TPG，113 mg，0.6 mmol）的DCM溶液，常温下反应2 h。薄层色谱监测反应完全，溶液呈黄色。反应结束用DCM/H2O萃取，收集有机相，得到化合物2；

3）将正丁氨（65 μL，1 mmol）溶于3 mL无水二氯甲烷中，加入三乙胺（260 μL），于冰浴、氮气保护下搅拌，注射滴加化合物2的二氯甲烷溶液。溶液变为淡红色。常温反应8 h，薄层色谱监测反应完全，反应结束溶液变为浅红色。用乙酸乙酯/水萃取反应液，有机相加无水硫酸钠干燥，产物通过柱色谱纯化（氧化铝，EA/PE＝1/8），得到灰白色固体MB-nBu（123 mg，Yield：32%）。

MB-nBu：1H-NMR（500 MHz, DMSO-d6）δ7.26（d,J＝8.8 Hz, 2H），6.72（d,J＝2.7 Hz, 2H），6.68（dd,J＝8.9, 2.9 Hz, 2H），5.96（t,J＝5.7 Hz, 1H）, 3.02（t,J＝4.5 Hz, 2H）, 2.90（s, 12H）, 1.40～1.35（m,2H）, 1.26～1.21（m, 4H）, 0.88～0.86（m, 3H）。13C-NMR（101 MHz, CDCl3）δ156.14, 149.00, 134.24, 128.70,127.33, 111.39, 111.06, 40.84, 40.70, 32.21, 29.79, 20.17. HRMS(ESI)：C21H28N4OS[M+H]+理论值：385.20174，实测值：385.20561。

1.3 光谱测试

将探针稀释至10 μM，在不同的pH中探针的荧光稳定性及不同浓度次氯酸存在时探针的光谱变化。在荧光发射光谱实验中，测试所用激发和发射波长为λex/em＝620 /680 nm，狭缝为10 nm，电压为700 V。

1.4 细胞成像

用完全培养基稀释探针溶液，使其终浓度为10 μmol/L，于CO2细胞培养箱中（37℃，含5%CO2，95%空气）孵育HeLa细胞30 min。后分别在培养基中加入用完全培养基稀释的终浓度为0、5 μM NaClO、2 μg/mL PMA（可诱导ClO-产生），在37℃继续孵育1 h。最后利用激光共聚焦观察成像结果（激发波长：620 nm；收集范围：650～750 nm）。

2 结果和讨论

2.1 探针MB-nBu的可能机理

由探针与NaClO响应后的吸收光谱（图2a）及高效液相色谱分析HPLC分析（图2b）结果，探针自身没有吸收，而后出现三个吸收峰291 nm、609 nm、668 nm，与已报道文献[25]中亚甲基蓝的最大吸收波长一致，证实了反应完全后亚甲基蓝（MB）的生成。由此推断探针MB-nBu对ClO-的反应，可能机理如图3所示。

图2 （a）探针MB-nBu及与ClO-响应后的吸收光谱（280～800 nm）；

图3 探针MB-nBu响应ClO-的可能机理

2.2 探针MB-nBu对ClO-的响应光谱

由于酰胺键的吸电子效应，MB-nBu自身无荧光发射。如图4所示，随着次氯酸的加入，酰胺键断裂荧光团荧光恢复，MB的特征吸收迅速显示，在680 nm处有一个峰，探针发出强烈的红色荧光。探针在680 nm处的荧光发射峰强度不断增高，荧光强度变大。当加入10 μM的ClO-时，荧光强度增强约100倍（从7到670），且当加入次氯酸10 μM时，探针的荧光发射基本达到平衡。另外，探针的荧光强度与0-10 μM的次氯酸浓度呈完美的线性关系（FL＝62.39[ClO-]＋23.99，R²＝0.998 1），检测限为29.7 nM。低的检测限表明该探针满足于细胞等生理状态中次氯酸的浓度（10-8～10-6M）检测。

图4 不同梯度浓度ClO-下（0～25 μM）：（a）探针MB-nBu的荧光发射光谱（640 nm～750 nm）；

2.3 探针的稳定性测试

为了研究探针的稳定性，测试了探针在不同酸碱度条件下的荧光强度，如图5a所示。可以看出，该探针在6.5～8.5的酸碱度范围内相对稳定，因此该探针具有在体内检测ClO-的潜力。考虑到这一点，选择了pH 7.4作为以后的实验。然后，测量了探针在不同浓度ClO-中的荧光强度随时间的变化。图5b显示，加入不同浓度的ClO-后，荧光强度立即增加到最大值（＜1s），然后保持相对稳定。在随后的120 s内，荧光强度保持稳定在最大值。极短的响应时间更适合对生物体中的ClO-物质进行实时成像。

图5 （a）不同pH条件，探针MB-nBu及有添加10 μM ClO-后的荧光强度；

2.4 探针的选择性测试

为了评估探针对ClO-的检测选择性，在加入各种干扰剂后，进一步研究了MB-nBu的和荧光响应光谱（图6），所述干扰剂包括: Blank、H2O2、ONOO-、·OH、NO、t-BuOO-、K+、Na+、Li+、Ag+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、NH4+、Cl-、CH3COO-、Br-、NO3-、I-、CO32-、SO42-、ClO4-、F-、S2O32-、S2O42-、Cys、GSH、Gly。加入50 μM的其他物种后，探针的荧光强度基本没有发生变化。结果表明该探针MB-nBu对ClO-的检测具有高选择性。

图6 （a）探针MB-nBu对不同分析物最大发射强度柱状图；

2.5 细胞毒性

这里通过MTT法来确定探针MB-nBu的细胞毒性，以0-100 μM的梯度浓度的探针溶液对HeLa细胞进行孵育24 h，观察24 h后细胞的存活率。如图4b所示，当探针的浓度在12.5 μM以内时，HeLa细胞能维持在90%以上的存活率。当孵育的探针浓度达到100 μM时，HeLa细胞的存活率依然在80%以上。结果表明，探针MB-nBu具有较低的细胞毒性，具有细胞水平成像应用的潜力。

2.6 细胞成像

由于探针MB-nBu具有对次氯酸较好的的识别性能、低的细胞毒性，进一步研究了探针在细胞中的成像能力。发现当仅用探针MB-nBu孵育细胞，基本没有观察到可见的荧光（a～c）。如图7所示，而当加入外源性ClO-（5 μM）孵育有探针的HeLa细胞时，通过细胞成像仪观察到有明显的红色荧光产生（d～f）。结果表明探针MB-nBu可在活细胞中检测ClO-浓度。在加入2 μg/mL 的PMA培育细胞后，细胞中出现明亮的红色荧光现象（g～i）。这证明了探针MB-nBu的细胞通透性良好，以及在活细胞中识别次氯酸的能力，可用于细胞内外源性及内源性ClO-的成像。

图7 共聚焦成像：细胞中只加入探针MB-nBu（a～c）、加入探针及次氯酸（d～f）、加入探针及PMA（g～i）

3 结论

以亚甲基蓝为荧光团，设计并合成出了一种具有高灵敏度、高选择性的ClO-荧光探针。探针MB-nBu对ClO-具有超快速（＜1s）、高特异性、低检测限、良好的荧光稳定性等优点，以及低的细胞毒性，并成功应用于HeLa细胞中的内源性和外源性ClO-的细胞成像。总之，探针MB-nBu在环境和生物学领域特异性检测ClO-方面有很好的应用前景。