Fe3O4纳米粒子的仿生修饰及叶酸靶向功能化研究

刘晓迪， 张寒思， 宋新峰

（1. 德州学院 医药与护理学院，山东 德州 253023；2. 华东师范大学 研究生院，上海 200062）

四氧化三铁（Fe3O4）纳米颗粒具有优良的磁学性能、量子隧道效应、比表面积高、粒径小、分布均匀、易于渗透和易被网状内皮系统吞噬等的特性，能明显增强的T2造影效应；并且，在外加磁场作用下Fe3O4将电磁能转化为热能，随磁场变化产生热效应，被用于疾病的热疗。因此，Fe3O4已被广泛地应用于生物医学领域[1]。但是，由于Fe3O4纳米颗粒粒径小、比表面能大，裸露的纳米粒子有强烈的聚集倾向，导致粒径尺寸大、分布宽，影响了在溶液中的分散性和生物相容性，无法满足生物医学的应用标准[2]。

通常通过对超顺磁性纳米粒子进行表面修饰，降低表面能，增强粒子抗氧化能力，提高粒子的分散性、溶解性和生物相容性。已有不少Fe3O4纳米颗粒的成功修饰方法，如徐光辉等[3]通过超声处理－化学镀法，利用正硅酸乙酯、AgNO3修饰制备Fe3O4@SiO2-Ag核壳纳米粒子。因贻贝类动物的粘附性蛋白超强粘附性能，美国西北大学的Messersmith等[4]提出一种利用多巴胺（DOPA）氧化聚合以及聚多巴胺沉积的新型仿生修饰方法，对聚四氟乙烯或聚乙烯等材料的表面改性。

受此启发，本文用一种温和、简易、环保的DOPA仿生修饰Fe3O4方法。

叶酸（FA）是人体必须的维生素，具有分子小、无毒且免疫原性低，渗透快等优点，能特异性地结合于肿瘤细胞表面过度表达的叶酸受体（Folate Receptor，FR）。FR在一些恶性肿瘤（如肝癌、卵巢、鼻咽、子宫内膜和肺癌等）高度表达，而正常的细胞不表达，使FR在肿瘤细胞的检测和靶向治疗方面发挥优势[5]。因此，本文将叶酸与磁性纳米粒子结合可以增加纳米材料在肿瘤部位的富集性，并且诱导肿瘤组织内的网状内皮系统的内吞作用，因此不仅作为靶向造影剂，还可进行靶向治疗。

1 实验

1.1 试剂与仪器

FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O （天津市耀华化工厂），多巴胺亚酸盐（北京百灵威科技有限公司），叶酸 （上海麦克林生化有限公司），RAW 264.7细胞（中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心）。

马尔文粒度仪（英国马尔文仪器有限公司），热重-差示量热扫描仪（美国梅特勒-托利多公司），振动样品磁强计（南京南大仪器有限公司），傅立叶变换-红外光谱仪（美国赛默飞公司），扫描电镜（德国卡尔蔡司公司），SDD能谱仪（牛津仪器（上海）有限公司）。

1.2 SPIONs@PDA-FA制备

参考崔生等[6]采用共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米颗粒。

按照Fe2+/2Fe3+＝1∶2摩尔比，精确称量FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O超声溶解分散于去离子水中。将上述溶液转入三口瓶中，氮气保护，常温（25℃）条件下，机械搅拌10 min（800 r/min），混匀。缓慢滴加浓度25% 氨水，使反应液pH值在9.85，氮气保护，常温（25℃）条件下，机械搅拌10 min（800 r/min）。

在上述反应结束，参考Lee H等[4]向反应液中滴加3.6%的盐酸溶液，调pH值至8.5，随后氮气保护下加入现配的多巴胺盐酸盐溶液；在25℃、有氧条件下，机械搅拌30 min（500 r/min）；反应完毕后，利用外加磁场分离、去离子水洗涤3遍，制得SPIONs@PDA。

称取已经制备好的SPIONs-PDA 0.3 g溶解到50 mL的无水吡啶，再加入0.5 g NHS-folate，在室温、避光条件下，机械搅拌24 h（200 r/min）；反应结束后，利用外加磁场分离产物，依次用乙醇-正己烷混合液、无水乙醇、去离子水洗涤3 次，然后将产物部分用真空干燥，制得SPIONs@PDA-FA颗粒。

1.3 三种磁性纳米粒子的表征及评价

对制备的SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三种纳米粒子按照测试要求进行处理，分别用扫描电镜、马尔文粒度仪、振动样品磁强计、差示-热重分析仪以及傅里叶红外光谱等对其形貌、粒径大小及分布磁学性能、化学组成等进行了表征，并考察了对体外巨噬细胞的内吞效应的影响。

2 结果与讨论

2.1 三种磁性纳米粒子的形貌分析

SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三种磁性纳米粒子的扫描电镜结果如图 1所示，SPIONs纳米粒子形态规则成球形结构，大小分布均匀，粒径在 20～30 nm之间（图1 A）；而SPIONs@PDA和SPIONs@PDA-FA两种纳米粒子的粒径较SPIONs裸粒子有所增加，粒子粒径约为30～40 nm（图1 B、图1 C），推断是由于DOPA包覆在SPIONs纳米粒子表面所致；因为 FA为小分子，在SPIONs@PDA纳米粒子表面键合的量有限，所以，其粒径无没明显变化。

图1 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）纳米粒子的电镜图

2.2 三种磁性纳米粒子的粒径分析

SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三种磁性纳米粒子的粒径如图2所示，均呈单峰分布，分布范围较窄，其平均粒径依次为315.1 nm、384.7 nm、398.4 nm，表明三种磁性纳米粒子大小均一。另外，SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA纳米粒子的马尔文粒径测量结果均比扫描电镜大，分析主要原因可能是Fe3O4在水中发生了团聚，导致SPIONs偏大；而Fe3O4表面被的DOPA、FA修饰后，增强了水合效应，从而使SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA纳米粒子的粒径增大。

图2 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）纳米粒子的粒径分布图

2.3 三种磁性纳米粒子的成分分析

大面积SDD能谱仪检测结果，如图3 A所示，SPIONs纳米粒子中含有Fe、O两种元素，提示Fe3O4。仿生修饰DOPA后，SPIONs@PDA纳米粒子中又出现了C、N两种元素，表明DOPA成功包覆在SPIONs纳米粒子表面。键合FA后的SPIONs@PDA-FA纳米粒子也出现了C、N两种元素，且这两种元素的含量增加，表明FA键合在SPIONs@PDA纳米粒子表面。

图3 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）纳米粒子的大面积SDD能谱元素测定图

2.4 三种磁性纳米粒子的结构分析

由图4 A可见，在578 cm-1处的吸收峰对应于 SPIONs中 Fe-O 键的振动；图4 B表明，芳香环官能团 C=C 伸缩振动的吸收峰出现在1457 cm-1和1760 cm-1处，而3253 cm-1处的吸收峰对应芳香环的 O-H伸缩振动，表明聚多巴胺已在SPIONs表面生成；如图4 C所示，SPIONs@PDA-FA出现了特征性的苯环峰值3050 cm-1，叶酸中的亚甲基（-CH2）的特征吸收峰出现在2929 cm-1处，于1644 cm-1和1490 cm-1处 出现由叶酸的蝶啶环和苯甲酰基伸缩震动产生的叶酸特征峰，这表明FA已成功键合到SPIONs表面，与潘广伯等[11]的研究结果一致。

图4 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）纳米粒子的红外分析谱图

2.5 三种磁性纳米粒子的组份测定结果

由图5中曲线A可知，从25℃升至150℃，纯 SPIONs纳米粒子的失重率约为5.03%，是 SPIONs纳米粒子表面吸附的水挥发所致，随着温度的升高，SPIONs纳米粒子发生相变而成为 Fe2O3。由图5中B可知，SPIONs@PDA纳米粒子的总失重率约为45.75%，除去表面吸附的水，还有包覆的DOPA。其中，在25～150℃的范围内主要是除去SPIONs@PDA纳米粒子表面吸附水，失重率约为10.02%；当温度高于150℃以后，随着温度的升高，包覆的DOPA开始缓慢分解并被除去，同时SPIONs纳米粒子发生相变而成为 Fe2O3。从这些数据看，DOPA修饰SPIONs的纳米粒子的含量约为35.73%。图5中C表明，SPIONs@PDA-FA纳米粒子的总失重率达到57.80%，其中从25℃升至150℃，主要是SPIONs@PDA-FA纳米粒子表面吸附的水，失重率约为11.53%；当温度高于150℃以后，随着温度的升高，包覆的DOPA、FA开始缓慢分解并被除去，同时SPIONs纳米粒子发生相变而成为 Fe2O3。由此，表明在SPIONs纳米粒子表面包覆的DOPA和键合的FA总量约为46.27%。再结合SPIONs@PDA纳米粒子的总失重情况，可以推断FA已经成功键合到DOPA包覆的SPIONs纳米粒子表面。

图5 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）纳米粒子的热重分析图

2.6 三种磁性纳米粒子的磁饱和强度测定结果

由图6中所示A、B、C三条磁滞回线显示，SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三种磁性纳米粒子均几乎没有剩磁和顽磁，矫顽力接近0，说明本实验制备的纳米粒子具有超顺磁性。另外，A、B、C三条磁滞回线也显示三种磁性纳米粒子有较好的磁饱和强度，其中SPIONs磁性纳米粒子的平均饱和磁矩值为52.30 emu/g，经多巴胺修饰后，SPIONs@PDA纳米粒子的饱和磁矩值降为46.60 emu/g，磁化强度下降，主要是多巴胺为无磁性的高分子物质，修饰在SPIONs纳米粒子表面，对其磁性造成影响，在多巴胺修饰的SPION纳米粒子表面键合FA后，SPIONs@PDA-FA纳米粒子的饱和磁矩值为39.43 emu/g，下降不明显，仍具有较好的的磁学性能，符合MRI成像要求[12]。

图6 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）纳米粒子的磁性检测

2.7 三种磁性纳米粒子的体外巨噬细胞摄取实验结果

将制备好的SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三种纳米粒子分别与小鼠巨噬细胞孵育24 h，结果如图7所示与A空白细胞比较，小鼠巨噬细胞对SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三种磁性纳米粒子均具有吞噬效应，而其中SPIONs@PDA-FA纳米粒子的吞噬效应略微优于其他两种纳米粒子。另外，三种纳米粒子的浓度梯度实验也表明随着纳米粒子浓度的增加，会提高小鼠巨噬细胞的内吞效果。

图7 空白细胞（A），分别吞噬SPIONs（B）、SPIONs@PDA（C）、SPIONs@PDA-FA（D）纳米粒子的细胞图

3 结论

本实验利用多巴胺的氧化自聚原理，实现了SPIONs纳米粒子的仿生修饰，并耦合FA赋予纳米粒子肿瘤靶向，形成了超顺磁性氧化铁-多巴胺-叶酸（SPIONs@PDA-FA）纳米复合物，建立一种温和的SPIONs仿生修饰方法，具有一定的创新性。多巴胺分子中羟基、氨基等亲水性官能团，改善SPIONs的水溶性及其生物相容性，该设计思路较为新颖。

利用DOPA作为连接体，将FA分子成功地与SPIONs纳米粒子偶联，实现了SPIONs粒子的靶向功能化，该化合物具有肿瘤细胞的靶向介导功能，且毒性小，扩大了在生物医学领域应用，如靶向给药、核磁共振成像、肿瘤细胞示踪等，具有重要的意义。功能化的SPIONs制备成功，一方面，降低SPIONs的高比表面能，改善粒子的聚沉，保持纳米颗粒单分散性，获得有良好水分散性、生物相容性，为其在生物学的广泛应用奠定基础；另一方面，提高了在肿瘤部位的富集，实现SPIONs造影剂肿瘤靶向性。