秦皮乙素调控miR-486-5p表达抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的机制研究

成 涛,王桂林,张秀容,张 涛,唐前容

(四川省宜宾市第二人民医院 急诊科,四川 宜宾,644000)

肾小管上皮细胞损伤可引起肾间质纤维化，是导致糖尿病肾病、急性肾损伤等肾脏疾病的主要原因和病理过程，其损伤机制包括氧化应激、肾组织炎症及免疫反应等，研究肾小管上皮细胞损伤机制对防治糖尿病肾病具有重要意义[1-2]。研究[3]表明中医药在防治肾小管上皮细胞损伤及炎症反应方面有独特的疗效。秦皮是在中国资源丰富且有巨大价值的中药材，其含有香豆素类、木脂素类及环烯醚萜类等多种化学成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用[4]。秦皮乙素(Esc)属于香豆素类成分，研究[5]报道Esc可减轻多柔比星诱导H9C2细胞的凋亡。Esc可通过上调细胞内抗氧化酶类物质活性来保护视网膜色素上皮细胞ARPE-19免受氧化损伤，表明Esc具有抗细胞损伤的作用[6]。目前，Esc对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的影响及机制尚不清楚。

研究[7]显示微小核糖核酸(miRNA)具有调控细胞凋亡的生物学特性，还参与炎症损伤等病理过程。研究[8]报道miR-486-5p可诱导炎症和细胞凋亡，从而促进急性肺损伤的发展。下调miR-486-5p可通过靶向核因子E2相关因子1(NRF1)减轻脂多糖诱导的软骨细胞ATDC5中的炎症性损伤、氧化应激和细胞凋亡，说明miR-486-5p可通过调节炎症反应来影响细胞损伤[9]。目前,miR-486-5p对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的影响以及Esc是否调控miR-486-5p的表达尚不清楚。本研究探讨Esc对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的影响，分析其相关机制与miR-486-5p的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂材料

肾小管上皮细胞HK-2(美国ATCC);DMEM培养基(美国Hyclone公司);D-葡萄糖、Esc(美国Sigma-Aldrich公司);白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)(艾美捷科技有限公司);凋亡检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司);RIPA蛋白裂解液(上海贝博生物公司);SYBR Premix ExTaqTM试剂盒(日本Takara公司)。

1.2 细胞处理与分组

肾小管上皮细胞HK-2随机分为对照(Con)组，高糖(HG)组，Esc低、中、高浓度(HG+Esc-L、M、H)组、HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-486-5p组、HG+Esc+miR-NC组、HG+Esc+miR-486-5p组。Con组采用葡萄糖浓度为5.5 mmol/L的培养基培养HK-2细胞;HG组采用葡萄糖浓度为25.0 mmol/L的培养基培养HK-2细胞;HG+Esc-L、M、H组分别采用20.0、40.0、80.0 μmol/L Esc和25.0 mmol/L葡萄糖处理;HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-486-5p组将anti-miR-NC、anti-miR-486-5p分别转染至HK-2细胞，而后采用25.0 mmol/L葡萄糖处理;HG+Esc+miR-NC组、HG+Esc+miR-486-5p组将miR-NC、miR-486-5p分别转染至HK-2细胞，而后采用80.0 μmol/L Esc和25.0 mmol/L葡萄糖处理。

1.3 ELISA法检测IL-6、TNF-α水平

取培养48 h的各组细胞上清液，按照各自试剂盒说明书操作，最后采用酶标仪检测450 nm处吸光度值(OD450 nm)。绘制标准曲线，根据样品OD值在标准曲线上查出相应的浓度。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

离心收集各组细胞，将细胞用预冷PBS洗涤，加入300.0 μL的结合缓冲液悬浮细胞;加入5.0 μL的膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)混匀，再加入5.0 μL的碘化丙啶(PI)染色;避光孵育10 min;上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达

收集各组细胞，加入适量RIPA裂解液提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后转膜，封闭后加入cleaved-caspase3、cleaved-caspase9抗体(1∶800),4 ℃孵育过夜，弃掉一抗，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶1 500),室温孵育2 h,显色,Quantity One分析蛋白条带灰度值，计算蛋白的相对表达量。

1.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测miR-486-5p表达水平

提取各组肾小管上皮细胞的总RNA,反转录成cDNA,以U6为内参进行PCR扩增，相对表达量采用2-△△Ct法计算。本研究中miR-486-5p上游引物序列为:5′-TCCTGTACTGAGCTGCCC-3′;下游引物序列为:5′-CTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6上游引物序列为:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;下游引物序列为:5′-GCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 Esc对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响

与Con组比较,HG组肾小管上皮细胞中IL-6、TNF-α水平升高，差异有统计学意义(P<0.05);与HG组比较,HG+Esc-L、M、H组肾小管上皮细胞中IL-6、TNF-α水平逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 Esc对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响

2.2 Esc对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响

与Con组比较,HG组肾小管上皮细胞的凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05);与HG组比较，HG+Esc-L、M、H组肾小管上皮细胞的凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

表2 Esc对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响

2.3 Esc对高糖诱导的肾小管上皮细胞miR-486-5p表达的影响

与Con组比较，HG组肾小管上皮细胞中miR-486-5p表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05);与HG组比较,HG+Esc-L、M、H组肾小管上皮细胞中miR-486-5p表达水平逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 Esc对高糖诱导的肾小管上皮细胞miR-486-5p表达的影响

2.4 抑制miR-486-5p表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的影响

与HG+anti-miR-NC组比较,HG+anti-miR-486-5p组肾小管上皮细胞中miR-486-5p表达、IL-6及TNF-α水平、细胞的凋亡率以及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表4。

表4 抑制miR-486-5p表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的影响

2.5 上调miR-486-5p表达减弱了Esc(80.0 μmol/L)对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的作用

与HG+Esc+miR-NC组比较，HG+Esc+miR-486-5p组肾小管上皮细胞中miR-486-5p表达水平、IL-6及TNF-α水平、细胞的凋亡率以及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表5。

表5 上调miR-486-5p表达减弱了Esc对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤的作用

3 讨 论

肾小管上皮细胞能够分泌多种炎症因子进入到肾间质，加速其炎症进程;肾小管上皮细胞受损后可直接参与肾间质纤维化，炎症反应和纤维化均在肾脏疾病的进展中起关键作用[10-11]。研究[12]报道Esc可拮抗单核细胞衍生的巨噬细胞浸润刺激的肺纤维化和肺泡上皮屏障破坏。Esc可减轻炎性细胞浸润以及促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、白介素-1β(IL-1β)的生成，改善脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤[13-14]。本研究采用不同浓度Esc作用于高糖诱导的HK-2细胞，结果显示,IL-6、TNF-α水平逐渐降低，细胞的凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平逐渐降低，表明Esc呈浓度依赖性地抑制高糖诱导的HK-2细胞炎症反应及凋亡。

研究[15]报道miR-486-5p下调并通过靶向胰岛素样生长因子1(IGF-1)保护心肌细胞免受缺氧诱导的细胞损伤。研究[16]显示miR-486-5p通过直接靶向叉头盒O类转录因子1(FOXO1)抑制髓核细胞的炎症反应、基质降解和凋亡。本研究结果显示，高糖诱导的HK-2细胞中miR-486-5p表达水平升高;抑制miR-486-5p表达后，高糖诱导的HK-2细胞中IL-6、TNF-α水平降低，细胞的凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平降低，表明抑制miR-486-5p表达可抑制高糖诱导的HK-2细胞炎症反应及凋亡。此外，本研究发现Esc可降低miR-486-5p的表达水平;过表达miR-486-5p和Esc同时处理后,IL-6、TNF-α水平升高，细胞的凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。上述结果显示,Esc可通过下调miR-486-5p表达抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤。