MYO15A基因新发突变导致先天性耳聋1例报道

靳春雷， 朱焕勉， 陈鹏龙， 雷 强

（丽水市妇幼保健院产前诊断中心，浙江 丽水 323000）

耳聋是人类常见的出生缺陷之一，主要与遗传因素和环境因素有关，其中遗传因素所致的耳聋占60%。在遗传性耳聋中，有30%伴有其他症状，被称为综合征性耳聋（syndromic sensorineural hearing loss，SHL）；其余70%不伴其他症状，被称为非综合征耳聋（nonsyndromic sensorineural hearing loss，NSHL）[1]。在遗传性耳聋患者中，有80%为常染色体隐性非综合征耳聋（autosomal recessive non-syndromic sensorineural hearing loss，ARNSHL）[2]。目前，已鉴定出70多个基因与ARNSHL有关（https：//hereditaryhearingloss.org/）。虽然导致耳聋的基因较多，但绝大多数遗传性耳聋只与少数几个基因有关。根据我国大规模的耳聋流行病学调查，大部分NSHL由4个基因（GJB2、SLC26A4、12SrRNA及GJB3）突变引起；而在ARNSHL中，MYO15A基因出现的频率仅次于GJB2、SLC26A4，是相对常见的耳聋致病基因之一[2]。由于该基因较大，且无明显的突变热点区域，因此常规耳聋基因检测并不包含此基因[3-4]。我们采用高通量测序[又称下一代测序（next generation sequencing，NGS）]技术及Sanger测序技术对1例耳聋患者进行基因检测，并进行家系验证及产前诊断。

1 材料和方法

1.1 病例资料

某孕妇，32岁，孕13周；丈夫36岁，夫妻双方表型正常，否认近亲结婚，无家族史，产检结果未见异常。因生育过先天性耳聋的儿子（先证者）来院就诊。先证者，4岁，出生时听力筛查未通过，常规耳聋基因检测未见异常，无氨基糖苷类药物用药史，颞部电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）检查未见异常。临床诊断为非综合征型感音神经性耳聋（左耳80 dB，右耳85 dB）。1岁之前植入人工耳蜗，听力、语言及智力发育正常。对先证者及其家系进行分子诊断，对胎儿进行产前诊断。家系遗传图谱见图1。

1.2 方法

1.2.1 样本采集及处理 采集先证者及其父母亲外周静脉血5 mL，其中2 mL采用Qiagen Blood DNA mini kit（德国Qiagen公司）提取基因组DNA，采用Qubit dsDNA HS Assay Kit（美国Invitrogen公司）测定浓度后-20 ℃保存备用。孕妇于孕19周时在超声指导下行羊水穿刺，对胎儿进行产前诊断。

1.2.2 基因捕获、建库及测序 采用常见耳聋基因panel的捕获oligo，采用多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）靶向富集目标区域序列。采用AgencourtAMPure XP磁珠（美国Beckman Coulter公司）纯化捕获产物。按TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina建库试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）说明书处理纯化产物，建库过程中每个样本都会加上特殊标签[TruePrep Index Kit V2 for Illumina（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）]。文库采用Qubit dsDNA HS Assay Kit（美国Invitrogen公司）测定浓度，采用2100 Bioanalyzer生物芯片分析系统（美国Agilent公司）及配套High Sensitivity DNA试剂盒分析片段大小，确定文库合格后采用DNA Standa ds and Primer Premix定量试剂盒（美国Illumina公司）对文库进行精确定量，确定上机样本量。采用MiSeq系统（美国Illumina公司）及配套MiSeq Reagent Kit V2（300 cycles）基因测序试剂盒进行测序。

1.2.3 Sanger测序验证 对发现的突变采用Sanger测序进行验证。取20 ng DNA，使用待测位点的特异性引物，按照LA PCR Kit Ver.2.1（日本TaKaRa公司）说明书进行PCR。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳分析，并切胶回收纯化。将回收产物稀释至10 ng/μL，按BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（美国ABI公司）说明书进行测序及纯化：每孔加入10 μL Hi-Di（美国ABI公司），变性5 min，取出置于冰上冷却，转入上机用96孔板中，在ABI 3500XL基因分析仪（美国ABI公司）上进行测序分析。

1.2.4 生物信息学与致病性分析 在ClinVar数据库和人类基因突变数据库（the Human Gene Mutation Database，HGMD）中查询有无检测出的突变的报道，在ExAC和 1000 Genomes数据库中查询该突变在正常人群中的发生频率。采用Mutation Taster软件、PRONEAN软件对该突变进行致病性预测。

1.2.5 母血污染鉴定 采用3130测序仪（美国ABI公司）及STR基因型检测试剂盒[含17个短串联重复序列（short tandem repeat，STR）][天昊基因科技（苏州）有限公司]检测孕妇外周血及羊水样本，测定结果采用GeneMapper软件进行分析。

2 结果

2.1 NGS及Sanger测序结果

NGS分析结果显示，先证者MYO15A基因第63、64号外显子分别存在c.10250-10252delTCC（p.S3417del）、c.10419-10423delCAGCT（p.S3474Pfs*42）杂合突变（参考基因组hg19）。Sanger测序结果显示，先证者的突变位点与NGS结果一致；父亲63号外显子存在c.10250-10252delTCC（p.S3417del）突变，母亲64号外显子存在c.10419-10423delCAGCT（p.S3474Pfs*42）突变。见图2。

图2 Sanger测序位点验证

2.2 生物信息学分析

对突变位点进行生物信息学分析，MYO15A基因的c.10250_10252del突变，其蛋白质第3 417位氨基酸发生缺失（p.S3417del），其下游氨基酸不发生改变。c.10419_10423del突变导致第3 474位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸，其后因移码突变而使终止密码子提前产生（p.S3474Pfs*42），导致多肽链合成提前终止，产生截断蛋白，造成蛋白质无法正常折叠，从而发生降解。采用Mutation Taster软件、PRONEAN软件对MYO15A的c.10250_10252del、c.10419_10423del突变进行有害预测，预测结果均显示为“有害”。

2.3 产前诊断

基于生物信息学分析结果，需对胎儿进行产前诊断。STR数据分析结果显示，胎儿DNA没有母血污染，且亲缘关系符合。Sanger测序结果显示，胎儿64号外显子存在c.10419-10423delCAGCT杂合突变，遗传其母亲。因该基因为隐性遗传，推测胎儿出生后出现先证者表型的可能性不大。经过遗传咨询，孕妇选择继续妊娠，产后随访结果显示婴儿听力正常。

3 讨论

耳聋是一种常见的具有表型和遗传异质性的疾病。在ARNSHL中MYO15A被认为是第3常见致病基因。MYO15A基因位于染色体17p11.2上，具有66个外显子，全长71 kb，编码3 530个氨基酸，其编码的肌球蛋白15对维持细胞形态、细胞运动、细胞器的转运及细胞信号的传导具有重要的生理作用，蛋白质结构分为头部、颈部、尾部3个区域：头部区域包括N-末端结构域和负责三磷酸腺苷活性的运动结构域；颈部区域包括钙调蛋白轻链结合相关的IQ基序；尾部区域包括2个肌球蛋白尾部同源物4（myosin tail homology 4，MyTH4）结构域、2个FERM结构域、1个SH3同源3结构域、1个C末端亚型I和PDZ的结合基序[4-5]。肌球蛋白15位于耳蜗和前庭毛细胞静纤毛的尖端，对传递知觉的毛细胞静纤毛的发育和维持有着重要作用[6-8]，有研究发现，MYO15A蛋白缺陷的小鼠毛细胞静纤毛之间没有任何联系，且毛细胞静纤毛的长度短于野生型小鼠，可使静纤毛之间机械传递机制中断，导致耳聋的发生[9-10]。由此可见，MYO15A蛋白是维持正常听力的重要组成部分。

在HGMD数据库中，关于MYO15A基因突变的报道有近300种，尚未发现突变热点，主要为错义突变，其次为无义突变、移码突变、剪切位点突变和插入/缺失突变。MYO15A基因编码的肌球蛋白15头部N-末端区域发生的突变，听力表型为有残存听力的非重度耳聋，而非-N端区域突变，表型多为先天性或语前重度耳聋[11]。本研究结果显示，MYO15A基因的c.10250_10252del和c.10419_10423del突变位于肌球蛋白15尾部的FERM结构域（非-N端区域突变），该结构域是1个蛋白结合模块，负责细胞质与膜之间的物质转运。有研究结果表明，该区域在不同物种之间具有高度保守性，正常的FERM结构域对静纤毛的延长和声音的探测是必不可少的，FERM结构域的突变可能会干扰蛋白质的正确折叠、相邻结构域之间的亲和力及域内相互作用[12-13]。动物实验结果显示，FERM结构域缺失最后6个外显子可导致shaker 2J小鼠异常短的静纤毛及阶梯状结构消失，引起耳聋[14-15]。本研究结果显示，FERM结构域第63、64号外显子的缺失突变导致先证者发生重度听力障碍。因此，发生在FERM结构域的突变常可导致重度甚至极重度听力损失。家系分析发现表型正常的父母分别携带这2个突变位点，符合ARNSHL表型共分离现象。在HGMD数据库中，有1篇文献报道了c.10250_10252del突变，该例非综合征型常染色体隐性遗传性耳聋患者携带此突变[16]，但ClinVar数据库未见报道。ExAC和 1000 Genomes数据库中未收录这2种突变在正常人群中的发生频率，说明这2种突变在人群中极为罕见。根据美国医学遗传学和基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）2015年发布的指南，这2种突变评级为“可能致病”，这为产前诊断提供了理论依据。本研究产前诊断结果提示胎儿仅存在c.10419-10423delCAGCT杂合突变，遗传自其母亲，从基因水平推测胎儿发生耳聋的可能性不大。产后随访结果也显示婴儿听力正常。

综上所述，MYO15A基因的c.10250_10252del和c.10419_10423del复合杂合突变是本例先证者耳聋的致病原因。本研究为该家系遗传咨询及再生育指导提供了分子病理学依据，新突变位点的发现也扩大了该基因的突变谱。