T-SPOT.TB检测在骨结核中的辅助诊断价值*

闫丽梅，王 静，史 君，赵 静，贾 鹏

1.内蒙古自治区人民医院重症医学科，内蒙古呼和浩特 010050；2.内蒙古医科大学附属医院风湿免疫科，内蒙古呼和浩特 010050；3.内蒙古医科大学基础医学院生理教研室，内蒙古呼和浩特 010050；4.内蒙古自治区人民医院骨科，内蒙古呼和浩特 010050

骨结核是肺外结核累及的主要部位，约占肺外结核的30%左右。骨结核是由结核分枝杆菌(MTB)感染骨、脊柱和关节所导致的疾病，通常发病隐匿，病程长，可影响骨骼的发育，容易致残。骨结核中最常见的是脊柱结核，约占骨结核的50%，占全身结核的3%～5%[1]。临床上诊断骨结核主要依据患者的临床表现、影像学检查、局部病灶的病理结果和MTB的培养。但由于MTB培养周期长、阳性率低，而病理诊断属于有创检查，使其临床应用受到限制。因此，迫切需要新的检测方法来提高骨结核的早期诊断率和准确性。

结核感染T细胞斑点(T-SPOT.TB)检测是近年来辅助诊断结核感染的新免疫学方法，被广泛使用于临床[2]。T-SPOT.TB的检测原理是采用MTB特异性抗原早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)和培养滤过蛋白10(CFP-10)肽段刺激T淋巴细胞，使其释放γ干扰素(INF-γ)，使用酶联免疫斑点法(ELISPOT)计数活化的效应性T淋巴细胞[3]。本文评价T-SPOT.TB检测在骨结核辅助诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2013-2017年内蒙古自治区人民医院和内蒙古医科大学附属医院送检的疑似骨结核患者的外周静脉血标本212例，其中男110例、女102例，平均年龄(54.06±14.76)岁。根据临床表现、影像学检查、细菌学、组织病理学等诊断分为骨结核组和非结核组。骨结核诊断标准：(1)病理学诊断，标本活检的组织病理结果显示为结核性肉芽肿和干酪样坏死组织；(2)细菌学诊断，局部脓液抗酸染色涂片或MTB培养提示阳性；(3)临床诊断标准，临床表现、影像学等支持结核、排除其他疾病，且诊断性抗结核治疗有效者。局部组织、脓液抗酸涂片和MTB培养阳性是目前确诊骨结核的金标准。骨结核组111例，包括脊柱结核72例(64.87%)，关节及其他部位骨结核39例(35.13%)；非结核组101例。两组性别、年龄资料见表1。

表1 骨结核和非结核组的基本资料

1.2方法

1.2.1提取单个核细胞(PBMC) 所有患者空腹抽取静脉全血4 mL，加入肝素锂抗凝管。加入同比例培养基混匀，将稀释后的全血缓慢加入淋巴细胞分离液离心管内，形成液面层，梯度离心分离PBMC，用细胞培养基清洗2次，离心后弃上清液，用AIM-V培养基调整细胞浓度为2.5×105/mL悬液。

1.2.2T-SPOT.TB检测 使用T-SPOT.TB检测试剂盒(Oxford Immunotec公司，生产批号：TEC220430、TEB086167、TEC233280)检测。每个标本设4个孔，分别将 A抗原(ESAT-6)、B抗原(CFP-10)、空白对照(AIM-V培养基)和阳性对照(植物血凝素)，加入到包被有INF-γ单抗的96孔板孔内，每孔各加入50 μL，然后加入分离后的细胞悬液100 μL，37 ℃、5%CO2培养箱放置16～20 h，弃细胞悬液后PBS洗涤3次，分别加入二抗和底物显色，吹干后读数。用ELISPOT斑点分析仪(AID公司)计数斑点形成细胞(SFCs)。每个斑点代表一个活化的特异性T淋巴细胞。减去空白孔后任一孔斑点≥6为阳性，如果空白孔斑点数≥6时，任一实验孔大于空白对照2倍为阳性。本试验设静脉血界值24 SFCs/106PBMC为阳性。A抗原和B抗原任一个阳性即为阳性。

1.3统计学处理 统计学分析用GraghPad Prism 8软件，计算诊断实验评价指标的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值；绘制ROC曲线，确定诊断最佳临界值。计数资料以例数表示，比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1骨结核和非结核组T-SPOT.TB检测结果比较 T-SPOT.TB检测辅助诊断骨结核的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为91.89%、63.37%、73.38%、87.67%。T-SPOT.TB检测在骨结核组和非结核组阳性数差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 骨结核和非结核组T-SPOT.TB检测结果比较(n)

2.2T-SPOT.TB不同抗原检测辅助诊断骨结核的效能分析 外周血ESAT-6抗原诊断骨结核的最佳临界值是46 SFCs/106PBMC，曲线下面积(AUC)是0.881 9。外周血CFP-10抗原诊断骨结核的最佳临界值是34 SFCs/106PBMC，AUC是0.878 0。ESAT-6+CFP-10抗原诊断骨结核的最佳临界值是88 SFCs/106PBMC，AUC是0.911 0。见表3。

表3 T-SPOT.TB不同抗原检测辅助诊断骨结核的效能分析

2.3T-SPOT.TB不同抗原检测辅助诊断脊柱结核的效能分析 外周血ESAT-6抗原诊断脊柱结核的最佳临界值是50 SFCs/106PBMC，AUC是0.895 1。CFP-10抗原诊断脊柱结核的最佳临界值是34 SFCs/106PBMC，AUC是0.878 4。ESAT-6 + CFP-10抗原诊断脊柱结核的最佳临界值是114 SFCs/106PBMC，AUC是0.912 3。见表4。

表4 T-SPOT.TB不同抗原检测辅助诊断脊柱结核的效能分析

3 讨 论

骨结核是肺外结核的重要组成部分，其疾病进展缓慢、无特异性临床表现，容易导致患者的骨关节实质性破坏，给临床诊断和治疗带来巨大的挑战。骨结核通常以局部疼痛和压痛为主要临床表现，同时伴有炎性指标增高[4]，临床常规应用的检测项目包括细菌学检测、免疫学检测、病理学检查和影像学检查等。细菌学和病理学检测虽然是结核病诊断的金标准，但存在一些缺陷，MTB培养时间长，病理学检测属于有创性检查，而且二者检测阳性率均较低。免疫学检测方法主要包括结核菌素试验和抗结核抗体检测，其灵敏度和特异度较差[5]。MRI等影像学检查在临床中也有重要作用，但一些症状不典型或疾病早期的患者往往影像学表现不显著，均给骨结核的诊断带来了难题[6]。T-SPOT.TB是近年来出现的免疫检测新方法[7]，研究证实，检测外周血T-SPOT.TB是诊断活动性和隐匿性结核病的有效方法[8]。除检测外周血T-SPOT.TB外，还可检测胸腔积液、腹水、脑脊液T-SPOT.TB[9]，不同种类标本联合检测T-SPOT.TB可提高结核病的诊断率[10-11]。有研究显示，T-SPOT.TB检测在肠结核中也有较好的辅助诊断价值[12-13]。本研究评价T-SPOT.TB检测对骨结核的辅助诊断价值。

本研究回顾性分析了疑似骨结核患者的全血标本212例，根据临床诊断分为骨结核组111例和非结核组101例，均进行了T-SPOT.TB检测。T-SPOT.TB检测辅助诊断骨结核的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别是91.89%、63.37%、73.38%、87.67%，结果提示T-SPOT.TB检测可作为诊断骨结核的有效辅助手段。YUAN等[14]报道对65 例疑似非典型性脊柱结核患者进行T-SPOT.TB检测，其灵敏度和特异度分别为83%和81%。姚利等[15]纳入8篇研究T-SPOT.TB检测对脊柱结核诊断价值的文献进行Meta分析，结果提示外周血T-SPOT.TB检测诊断脊柱结核的灵敏度为88%，特异度为90%，阳性似然比为8.67，阴性似然比为0.13，AUC为0.95。本研究中T-SPOT.TB检测诊断骨结核的特异度与以上报道一致，但灵敏度略低。

临床上使用的试剂盒上推荐的外周血T-SPOT.TB诊断临界值是24 SFCs/106PBMC，适用于肺内结核的诊断，但对于骨结核T-SPOT.TB的诊断临界值报道不一。本研究根据入组患者外周血ESAT-6、CFP-10抗原单项检测和ESAT-6+CFP-10 抗原联合检测，建立ROC曲线，确定诊断骨结核的最佳临界值，骨结核外周血ESAT-6抗原的诊断最佳临界值是46 SFCs/106PBMC，CFP-10抗原的诊断最佳临界值是34 SFCs/106PBMC，均高于试剂盒上推荐的临界值。脊柱结核通常占全身骨结核的发病首位，本研究病例中也显示脊柱结核发病率较高，占骨结核组的64.87%，因此，将脊柱结核也做了单独统计，其诊断最佳临界值与骨结核组基本一致。ESAT-6+CFP-10抗原诊断骨结核的最佳临界值是88 SFCs/106PBMC，AUC明显优于ESAT-6或CFP-10单抗原检测，具有较好的灵敏度和特异度。

综上所述，T-SPOT.TB检测可作为辅助诊断骨结核的有效方法，ESAT-6+CFP-10抗原联合检测的诊断效能优于单抗原检测。