超高效液相色谱串-联质谱检测小麦中唑啉草酯及其代谢物M4

吴迟　何明远　欧阳小庆等

中图分类号：S 481.8 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2020599

唑啉草酯为先正达公司开发的苯基吡唑啉类除草剂，具有内吸传导性，作用机理为乙酰辅酶羧化酶（ACC）抑制剂，造成脂肪酸合成受阻，使细胞生长分裂停止，细胞膜含脂结构被破坏，导致杂草死亡。唑啉草酯主要用于大麦和小麦田防除一年生禾本科杂草，如大穗看麦娘Alopecurus myosuroides Huds.、阿披拉草Apera spica-venti L.Beauv.、燕麦Avenasativa L.、黑麦Secale cereale L.、狗尾草Setaria viridis（L.）Beauv.等主要禾本科杂草，对小麦安全性高。有研究表明，5%唑啉草酯乳油80、100 mL/667m²对小麦田4～5叶禾本科杂草（蔺草Schoenoplectus trigueter （L.）Palla、看麦娘Alopecurus aequalis Sobol.为主）防除效果优良，药后35 d株防效分别达到92. 9%和96.1%，鲜重防效分别达到97. 7%和99.1%。由于其防效好、安全性高，唑啉草酯发展迅速，先后在美国、英国、加拿大以及澳大利亚取得登记。2010年唑啉草酯原药单剂和复配制剂在中国取得登记。唑啉草酯在植物体内迅速代谢为M2，而后羟基化为代谢物M4。唑啉草酯及其代谢物M4被视为唑啉草酯用以制定其MRL值及膳食评估的定义指标。因此，研究建立唑啉草酯及其代谢物M4在小麦中的检测方法具有重要意义。

目前，唑啉草酯的残留检测方法主要有液相色谱一串联质谱法（LC-MS/MS）和高效液相色谱法（HPLC）。前处理大多采用QuEChERS法。国内对于唑啉草酯的测定研究大多是对于大麦样品，而对唑啉草酯在小麦上的检测方法研究较少，未见其代谢物M4在小麦上的测定研究报道。本文采用超高效液相色谱法串联质谱法开展了唑啉草酯及代谢物M4在小麦上的残留试验，建立了UPLC-MS/MS快速检测唑啉草酯和代谢物M4在小麦中的残留分析方法，为该药剂在小麦上的安全使用提供方法与依据，为农产品安全监测和膳食评估提供技术支撑。

1材料与方法

1.1仪器和试剂

超高效液相色谱质谱联用仪（Waters XevoTQD），沃特世科技上海有限公司;色谱柱为ACQU-ITY UPLC BEH C18（2.1 mmX50 mm，1.7μm），Waters公司;ACQUITY UPLC BEH HILIC（2.1mm×50 mm，1.7μm），Waters公司;Insert Sustain

C8（2.1 mm×75mm，3μm）， GLS Sciences公司;分析天平（MS105），梅特勒托利多仪器上海有限公司;电子天平（YP502N），上海菁海仪器有限公司;数控超声波清洗器（KQ-500DE），昆山市超声仪器有限公司;移液器，Eppendorf;台式高速离心机（TG-18），四川蜀科仪器有限公司;0.22μm微孔滤膜，天津博纳艾杰尔公司;多管旋涡混合器（UMV2），北京优晟联合科技有限公司。

唑啉草酯标准品（纯度99.1%），北京勤诚亦信科技开发有限公司;唑啉草酯代谢物M4标准品（纯度99. 7%），上海洲锐生物科技有限公司;N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、石墨化碳黑（GCB）、多壁碳纳米管（MWCNT），天津博纳艾杰尔公司;乙腈、甲酸、乙酸、HCl（色谱纯，分析纯），赛默飞世尔科技有限公司;氯化钠（分析纯）、无水乙酸钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

1.2样品前处理方法

1.2.1麦粒中唑啉草酯提取

采用优化的QuEChERS方法，称取（10. 00±0.05）g麦粒于50 mL离心管中，加入10.0 mL去离子水，10.0 mL0.1%甲酸乙腈，混匀，超声提取15min，然后向离心管中加入6g无水MgSO₄，1，1.8g无水NaAC，2400 r/min涡旋2min，4000 r/min离心5 min，上清液待净化。取上清液1.600 mL于装有50 mg PSA的离心管中，2400 r/min涡旋2 min，10 000r/min离心2 min，取上清过0.22μm微孔滤膜，待测。

1.2.2麦粒中唑啉草酯代谢物M4提取

采用优化的QuEChERS方法，称取（5.00±0. 05）g麦粒于50 mL离心管中，加入10. 00 mL1 mol/L HCl，混匀，80'c水浴超声30 min，加入10.0 mL乙腈，80℃水浴超聲提取15 min，冷却至室温后，向离心管中加入5. 00g NaCl，4.00 g无水MgSO₄，2400r/min涡旋2min，4 000 r/min离心5 min，上清液待净化。取上清液1.600 mL于装有50 mg C18的离心管中，2400 r/min涡旋2 min，10 000 r/min离心2 min，取上清过0.22μm微孔滤膜，待测。

1.2.3秸秆中唑啉草酯提取

采用优化的QuEChERS方法，称取（1. 00±0. 05）g秸秆于50 mL离心管中，加入10.0 mL去离子水，10.0 mL0.1%醋酸乙腈，混匀，超声提取15 min，然后向离心管中加入6g无水MgSO₄，1.8 g无水NaAC，2400 r/min涡旋2min，4000r/min离心5 min，上清液待净化。取上清液1.600 mL于装有50 mg PSA的离心管中，2 400 r/min涡旋2 min，10000 r/min离心2 min，取上清过0.2μm微孔滤膜，待测。

1.2.4秸秆中唑啉草酯代谢物M4提取

采用优化的QuEChERS方法，称取（1.00±0.05）g秸秆于50 mL离心管中，加入10. 00 mL 1mol/LHC1，混匀，80℃水浴超声30 min，加入10.0 mL乙腈，80℃水浴超声提取15min，冷却至室温后，向离心管中加入5. 00gNaCl，4.00g无水MgSO₄，2400r/min涡旋2 min，4000r/min离心5min，取上清4.000mL，旋蒸近干，用1. 000 mL乙腈定容，待净化。将旋蒸瓶中溶液分别转移至装有50 mg C18的离心管中，2400r/min涡旋2 min，10000r/min离心2min，取上清过0.22μm微孔滤膜，待测。

1.3唑啉草酯及其他代谢物M4的检测

1.3.1色谱柱和净化剂的选择

本研究考察了3种色谱柱C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm），C8柱（2.1mm×75 mm，3μm）和LCHILIC（2.1mm×50 mm，1.7μm）对唑啉草酯和唑啉草酯代谢物保留和响应的影响。当流动相为乙腈水相（70：30），且水相中含有0.01%的甲酸时，采用上述色谱柱分别对o.25 mg/l_的唑啉草酯和唑啉草酯代谢物标准溶液进行分析测定。麦粒和秸秆基质中唑啉草酯分别采用乙腈、甲醇、0. 1%甲酸乙腈和0.1%的醋酸乙腈提取，麦粒和秸秆中唑啉草酯代谢物M4分别采用乙腈、0. 1%甲酸乙腈、0.1%醋酸乙腈、10 mL 1mol/L HCl+10 mL乙腈提取，80℃水浴中超声辅助提取，以PSA为净化材料，选择最优提取剂。

1.3.2色谱条件

色谱柱为AOQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm），柱温为40℃。唑啉草酯流动相为乙腈和0. 01%甲酸水溶液（70. 0/30.0）等度洗脱，流速为0.4 mL/min;进样量为2μL。唑啉草酯代谢物M4流动相为乙腈和0.01%甲酸水溶液二元梯度洗脱，流速0.4 mL/min;进样量为5μL;梯度洗脱条件见表1。

1.3.3质谱条件

电喷雾离子源，正离子电离模式（ESI+）。离子源温度150℃，去溶剂温度500℃，去溶剂气（N₂）流量1000L/Hr，锥孔反吹气（N₂）流量50L/Hr。唑啉草酯毛细管电压1. 99kV，唑啉草酯代谢物M4毛细管电压3. 80 kV。采用MRM多重反应监测，以保留时间和离子对（母离子和2个子离子）信息比较进行定性分析;以母离子和响应值最高的子离子进行定量分析。具体质谱参数见表2。

1.4方法验证

1.4.1标准曲线绘制

采用麦粒、秸秆基质空白提取液做溶剂，分别稀释唑啉草酯标准溶液和唑啉草酯代谢物M4，得到浓度为0. 000 5、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的基质标准溶液，现配现用。采用麦粒基质空白提取液做溶剂，稀释标准溶液，得到浓度为0. 005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的麦粒基质标准溶液。采用秸秆基质空白提取液做溶剂，稀释标准溶液，得到浓度为0. 002、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的秸秆基质标准溶液。按1.3条件进行检测，分别以唑啉草酯和唑啉草酯代谢物M4的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.4.2添加回收以及精密度准确度

在空白麦粒中添加3个水平浓度的唑啉草酯标准溶液，添加水平分别为0. 001、0.01 mg/kg和0.1 mg/kg。在空白秸秆中添加3个水平浓度唑啉草酯标准溶液，添加水平分别为0. 01、0.1 mg/kg和1. 00 mg/kg。在空白麥粒中添加3个水平浓度的唑啉草酯代谢物M4标准溶液，添加水平分别为0.01、0.1 mg/kg和1.0 mg/kg。在空白秸秆中添加3个水平浓度唑啉草酯代谢物M4标准溶液，添加水平分别为0. 05、0.1 mg/kg和0.5 mg/kg，每个添加水平浓度重复5次。按1.3条件进行检测，计算添加回收率及相对标准偏差（RSD）。

2结果与分析

2.1唑啉草酯及其代谢物M4的检测

2.1.1检测条件优化

为获取唑啉草酯、唑啉草酯代谢物M4多反应监测参数，采用在质谱直接进标准品的方式，在100～500 m/z范围内扫描，对正离子电离（ESI⁺）和负离子电离（ESI^-）同时进行监测。结果表明，在ESI⁺模式下，唑啉草酯和唑啉草酯代谢物M4具有明显的特征离子峰[M+H]。再调整合适的锥孔电压选定母离子，调节碰撞能量，进一步获得定量和定性离子及相应的碰撞能量，最终优化条件如1.3所示。进一步优化色谱条件，最终唑啉草酯、唑啉草酯代谢物M4均采用乙腈-0.01%甲酸水溶液体系为流动相，在所设梯度洗脱条件下得到较好的灵敏度、重现性及峰形（图2）。

2.1.2色谱柱选择

唑啉草酯及其代谢物M4在LCHILIC柱上的保留时间有所增加，色谱峰形较差，为准确定量带来困难。二者在C18、C8色谱柱上的保留时间相当，但在C8色谱柱上的响应明显不如于C18色谱柱。因此，选取C18色谱柱用于唑啉草酯及其代谢物的分析测定。

2.2麦粒和秸秆样品前处理方法的优化

2.2.1提取溶剂的选择

以添加回收率为指标，结果表明，0.1%甲酸乙腈对麦粒中唑啉草酯的提取效果最佳，0. 1%醋酸乙腈对秸秆中唑啉草酯的提取效果最佳，在80℃水浴中加热超声辅助条件下，10mL 1mol/LHCl+10 mL乙腈对麦粒与秸秆中唑啉草酯代谢物M4提取效果最佳。相对于乙腈，酸化乙腈的提取效率更高。唑啉草酯代谢物M4存在游离态与共轭态，添加1mol/L HCl，以水浴加热超声辅助提取，更有利于样本中共轭态M4游离，结果见表3。

2.2.2净化剂的选择

唑啉草酯分别采用GCB、PSA、多壁碳纳米管净化，唑啉草酯代谢物M4分别采用PSA、C18和GCB净化。净化后，上清液均变澄清，说明4种净化方式都能很好地去除色素。不同净化剂对麦粒和秸秆基质中0. 100 mg/kg添加浓度的唑啉草酯及唑啉草酯代谢物M4的回收率影响不同。50 mg GCB、50 mg PSA、10 mg多壁碳纳米管净化后，麦粒基质中唑啉草酯的回收率范围分别为70. 3%～79. 1%、71. 9%～77. 3%、65.2%～73.7%，秸秆基质中唑啉草酯的回收率分别为58. 9%～64. 8%、72. 0%～77. 1%、40. 2%～57. 1%; 50 mg C18、50 mg GCB、50 mg PSA净化后，麦粒基质中唑啉草酯代谢物M4的回收率分别为70. 3%～78.1%、69. 2%～77. 3%、55. 2%～62.3%。秸秆基质中唑啉草酯代谢物M4的回收率分别为78. 9%～84. 8%、72. 0%～77.1%、59. 5%～65.4%。结果表明，麦粒与秸秆基质中，选用PSA为净化剂唑啉草酯添加回收均满足要求，选用C18为净化剂唑啉草酯代谢物M4添加回收均满足要求（回收率在70%～120%之间）。结果见图3。

2.3方法验证

2.3.1基质标准曲线绘制

基质匹配外标法定量分析，结果表明在0. 000 5～0.5 mg/L的质量浓度范围内，唑啉草酯和唑啉草酯代谢物M4的峰面积（y）与其质量浓度（x）呈现良好的线性关系。

2.3.2添加回收试验的准确度和精密度

在0. 001、0.010mg/kg和0.100 mg/kg添加水平下，唑啉草酯在麦粒中的平均回收率为77. 6%～90.4%，RSDs为1.71%～3.64%;在0. 010、0. 100 mg/kg和1.000 mg/kg添加水平下唑啉草酯在秸秆中的平均回收率为76. 7%～84.4%，RSDs为4.35%～9. 36%。在0.010、0.100 mg/kg和1. 000 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代谢物M4在麦粒中的平均回收率为81. 9%～89.4%，RSDs为5. 51%～13. 90%。在0.050、0.100 mg/kg和0. 500 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代谢物M4在秸秆中的平均回收率为74. 5%～89. 2%，RSDs为3.14%～15. 60%（表5）。唑啉草酯在麦粒、秸秆中的定量限分别为0. 001 mg/kg和0.01 mg/kg;唑啉草酯代谢物M4在麦粒、秸秆中的定量限分别为0.01 mg/kg和0.05 mg/kg，该方法的回收率、准确度、精密度、灵敏度均满足《农作物中农药残留试验准则》的检测要求。

3结论与讨论

本研究采用QuEChERS方法进行样品前处理，建立了UPLC-MS/MS测定小麦麦粒和秸秆中唑啉草酯及其代谢物M4的残留分析方法。提取溶剂的选择与目标化合物的溶解性质以及目标化合物存在的基质有关。常用的有机提取溶剂有乙腈、甲醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等，其中乙腈对大多数农药具有良好的溶解性以及较小的杂质溶出度，甲醇也是一种比较好的提取溶剂，但其揮发性较大，而且与水互溶，往往容易造成提取后共存的水分难以除去。而提取溶剂酸化具有保证目标物的稳定性，提高提取效率的作用。QuEChERS方法常用的净化材料有C18、PSA、GCB、无水硫酸镁和多壁碳纳米管等，其中C18可吸附样品中的脂肪和蛋白质，PSA主要吸附样品中的脂肪酸和糖类杂质，GCB主要去除植物中的叶绿素等杂质，无水硫酸镁可去除样品中的水分。本文筛选了唑啉草酯与唑啉草酯代谢物M4在麦粒和秸杆基质中最佳提取溶剂与最佳净化剂。在0. 000 5～0.5mg/L范围内，唑啉草酯和唑啉草酯代谢物M4的浓度与色谱峰面积均呈现良好的线性关系;在0. 001、0.010 mg/kg和0. 100 mg/kg添加水平下，唑啉草酯在麦粒中的平均回收率为77. 6%～90.4%，RSDs为1.71%～3.64%;在0. 010、0.100 mg/kg和1.000 mg/kg添加水平下唑啉草酯在秸秆中的平均回收率为76. 7%～84.4%，RSDs为4.35%～9.36%。在0. 010、0.100 mg/kg和1.000 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代谢物M4在麦粒中的平均回收率为81. 9%～89.4%， RSDs为5.51% N13. 90%。在0. 050、0.100 mg/kg和0.500 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代谢物M4在麦粒中的平均回收率为74. 5%～89. 2%，RSDs为3.14%～15. 60%。唑啉草酯在麦粒、秸秆中的定量限分别为0. 001 mg/kg和0. 01 mg/kg;唑啉草酯代谢物M4在麦粒、秸秆中的定量限分别为0. 01mg/kg和0.05 mg/kg。与韩何丹等建立的HPLC-MS/MS测定唑啉草酯的方法相比，本研究的定量限更低，灵敏度更高。该方法快速简便，准确可靠。与JMPR上提供的HPLC-MS/MS测定唑啉草酯代谢物M4的方法相比，该方法经济快速，操作简单。