超高效液相色谱串联质谱检测小麦中唑啉草酯及其代谢物M4

吴迟　何明远　欧阳小庆等

中图分类号：S 481.8 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2020236

核桃Juglans regia L.又名胡桃、羌桃，与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”。核桃因为其美味香甜且含有丰富的、对人体有利的不饱和脂肪酸，以及大量维生素、微量元素等而深受人们喜爱。中国是世界上核桃起源中心之一，世界核桃生产第一大国，拥有最大的種植面积和产量，出口量仅次于美国，居世界第二。然而，核桃常发生黑斑病、炭疽病、白粉病等病害，严重者导致果仁变黑腐烂，甚至树木死亡。在我国登记在核桃上的农药有防治白粉病的石硫合剂和防治干腐病的喹啉铜和肟菌·戊唑醇。肟菌·戊唑醇水分散粒剂是近期拜耳股份公司登记在核桃上的农药，对作物兼具保护和病害治疗的作用，并且具有增产的功效，为防治核桃树干腐病的新选择，应用前景良好。

戊唑醇（tebuconazole）是一种高效、具有保护作用和治疗作用的三唑类杀菌剂，广泛用于蔬菜、水果和谷物中霜霉病、白斑病、黑斑病和软腐病等病害的防治，其杀菌谱广、持效期长。戊唑醇对大鼠具有明显的毒性和生殖影响，美国环保署（EPA）已经将其分级为“潜在人类致癌物”。肟菌酯（trifloxys-trobin）是以天然产物strobilurins作为先导化合物研发的新型含氟杀菌剂，属甲氧基丙烯酸酯类农药。作为一种线粒体呼吸作用抑制剂，肟菌酯可以影响细胞三磷酸腺苷（ATP）酶合成，从而发挥抑菌效果。由于其具有高效、广谱、持效期长等特性，且对作物和环境安全，常用于防治稻瘟病、稻曲病、纹枯病等。在植物吸收肟菌酯后，会将其代谢成为肟菌酸（trifloxystrobin acid），肟菌酸的毒性较高，在环境中具有迁移转化性和持久性。

戊唑醇的分析方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱质谱法和液相色谱质谱法等，肟菌酯的分析方法主要有高效液相色谱法、气相色谱质谱法和气相色谱配NPD检测器等，但其代谢物的分析方法文献报道相对较少。张煜卓利用QuEChERS前处理联合GCMS-TQ8050气相色谱三重四极杆质谱联用仪建立了测定核桃等5种坚果中戊唑醇和肟菌酯等70种农药的残留检测方法。张婷亭建立了低温冷冻-分散固相萃取-UPLC-QqLIT-MS法测定核桃等4种坚果中戊唑醇等100种农药残留检测分析方法。GCMS-TQ8050和UP-LC-QqLIT-MS价格昂贵，普通实验室难以实现。对于同时检测戊唑醇、肟菌酯和肟菌酯代谢物肟菌酸在核桃基质中的方法国内外尚未见报道。本文建立了同时测定核桃中戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸残留量的超高效液相质谱-串联质谱法，该方法简便、快捷、灵敏度高，为上述3种物质在核桃基质中的残留监控和质量安全评价提供技术支撑。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

UHPLC-MS/MS（UltiMate 3000/TSQ VAN TGE，Thermo Fisher公司）;TG 16-Ⅱ离心机，湖南平凡科技有限公司;TG16离心机，长沙迈森仪器有限公司;XW-80A涡旋仪，海门其林贝尔仪器制造有限公司;ID5002C电子天平，天津天马衡基有限公司;CK2000高通量组织研磨器，北京托摩根生物科技有限公司;粉碎机，浙江荣浩工贸有限公司。

戊唑醇、肟菌酯、肟菌酸标准品，纯度分别为99. 7%、99. 2%和98. 0%，德国拜耳公司提供;分析纯的无水硫酸镁、氯化钠、乙腈，天津科密欧化学试剂有限公司;99. 8%冰乙酸，天津光复科技发展有限公司;乙腈，色谱纯，默克公司;88%甲酸，赛默飞世尔科技（中国）有限公司;蒸馏水，屈臣氏;SHIMSEN DISC滤膜（0. 22μm）;N-丙基乙二胺（PSA），石墨化碳黑（GCB），天津博纳艾杰尔科技有限公司;弗罗里硅土（florisil），天津市光复精细化工研究所;75%戊唑醇·肟菌酯水分散粒剂（WG），拜耳股份公司。

1.2标准溶剂的配制及标准曲线的绘制

分别称取戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸标准品各0.0100g±0.0001g、0.0101g±0.0001g和0.0102g±0.0001g，用色谱级乙腈做溶剂分别配制成100mg/L的储备液100mL，得到100 mg/L的戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸标准储备液，于4℃下保存。准确移取适量储备液，分别用乙腈、核桃空白基质将戊唑醇稀释成质量浓度为0. 002 5、0.01、0. 025、0.25、0.5 mg/L的溶剂标准溶液和基质标准溶液;将肟菌酯和肟菌酸稀释成质量浓度为0. 001、0. 01、0.05、0.1、0.5 mg/L的溶剂标准溶液和基质标准溶液。UHPLC-MS/MS进样检测，以峰面积（y）对戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸标准溶液的质量浓度（x，μg/L）作图，通过最小二乘法拟合得到标准曲线方程。

1.3提取与净化

准确称取粉碎后的核桃样品5g于50 mL离心管中，加入5ml_超纯水，待样品完成润湿后，加入10 mL 2%的乙酸乙腈，以1000r/min振荡提取10 min，加入2g氯化钠和3g无水硫酸镁，振荡5 min，以5000 r/min离心5 min。移取1.5 mL上清液于装有150 mg无水硫酸镁+50 mg弗罗里硅土的2mL离心管中，涡旋30 s，以5000r/min离心5 min，过0.22μm有机滤膜至进样瓶中，待测。

1.4仪器条件

1.4.1色谱条件

C18色谱柱（100 mmX2.1mm，1.9μm，ThermoFisher公司）;二元梯度洗脱分离，流速0.25 ml/min，进样体积5μL，以乙腈（A）和0.2%甲酸水溶液（B）（V/V）为流动相进行梯度洗脱，0～1.0 min，5%A;1.0～1.3min，5%～95%A;1.3～4.5min， 95%A;4.5～4.8min，95%～5%;4. 8～5.5min，5%A。

1.4.2质谱条件

采用超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）电喷雾离子源，选择反应监测（SRM）正离子模式（ESI+）;毛细管温度350℃;电喷雾电压3 200 V;离子传输管温度320℃;鞘气和辅助气均为氮气，鞘气流速30arb，辅助气流速10arb;戊唑醇：定量离子对307. 9>69.8，定性离子对307. 9>124.8，S-leans射频电压62 V，碰撞电压为20 V（定量离子）和29 V（定性离子）。肟菌酯：定量离子對408. 6>144.7，定性离子对408. 6>185.8，S-leans射频电压67 V，碰撞电压为41 V（定量离子）和16 V（定性离子）。肟菌酸：定量离子对395. 0>144.7，定性离子对307. 9>147.8，S-leans射频电压59 V，碰撞电压为37 V（定量离子）和10 V（定性离子）。

2结果与分析

2.1提取剂的选择

戊唑醇的添加浓度为0. 05mg/kg，肟菌酯、肟菌酸的添加浓度为0.2mg/kg时，分别用乙腈、1%乙酸乙腈、2%乙酸乙腈和5%乙酸乙腈对核桃中戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸进行提取。4种不同提取剂的提取效果及相对标准偏差（RSD）如图1所示，使用乙腈为提取剂时，添加平均回收率为33%～119%;使用1%乙酸乙腈为提取剂时，添加平均回收率为111%～131%、使用5%乙酸乙腈作为提取剂时，添加平均回收率为106%～122%，超过NY/T788-2018标准规定的回收率范围（70%～120%）。而使用2%乙酸乙腈为提取剂时，样品添加平均回收率为80%～110%，相对标准偏差（RSD）<5%，回收率和相对标准偏差范围均符合NY/T 788-2018标准规定范围。因此试验提取剂选择2%乙酸乙腈。

2.2净化剂的选择

在QuEChERS方法中，比对不同净化剂的净化效果。PSA可以有效去除样品中的有机酸、色素和糖类物质;十八烷基键合硅胶（C18）可以从极性样品中提取糖类和脂类物质，主要用于反相萃取;弗罗里硅土可以从非极性溶液中萃取极性化合物，主要吸附脂肪酸;GCB主要吸附一些平面结构的物质，如色素。在2.1中确定提取溶剂为2%乙酸乙腈，在戊唑醇的添加浓度为0. 05 mg/kg和肟菌酯及其代谢物肟菌酸的添加浓度为0.2 mg/kg的条件下，考察了C18、PSA、弗罗里硅土、GCB和C18+PSA组合（C18、PSA、弗罗里硅土均为50 mg再加入150 mg无水硫酸镁，GCB为20 mg加入150 mg无水硫酸镁，C18+PSA为各50 mg再加入150 mg无水硫酸镁）净化剂的净化效果（图2）。结果发现，以C18、PSA、弗罗里硅土、GCB、C18+PSA为净化剂时回收率分别为95%～115%、80%～95%、100%～102%、94%～104%、91%～99%，数据均符合NY/T 788-2018标准规定的回收率范围（70%～120%）。本文将进一步通过测定和计算基质效应，考虑从基质效应大小方面选择净化剂。

2.3标准曲线与基质效应

基质效应的强弱在一定程度上与基质种类有关，同时基质效应还受提取农药化学结构理化性质以及提取浓度、提取溶剂等的影响，如一些含有氨基、羟基和氨基甲酸酯基等官能团的农药极易吸附在检测器进样口的活性位点上，导致样品基质效应变化。此外，检测器的不同和进样方式的不同也会对基质效应产生影响，基质效应（matrix effect，ME）的大小以基质标准溶液曲线的斜率与标准溶液曲线斜率的比值来表示。

ME=（基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1）×100%。

通过测定不同样品基质标准浓度的峰面积，计算出相应的基质标准曲线的斜率，以基质效应（ME）作为评估基质效应的指标。当ME=0，则该基质不存在基质效应;当-20%50%时为强基质效应。

按照1.2方法得到戊唑醇、肟菌酯及其代谢物的溶剂标准曲线方程如表1所示，结果表明在使用的5种净化剂的条件下，在系列浓度范围内，戊唑醇、肟菌酯及其代谢物的峰面积所形成的溶液浓度方程的线性关系良好。

基于2.2节中5种净化剂进行样品基质效应的测定和计算。戊唑醇、肟菌酯及其代谢物肟菌酸在核桃中的基质效应如表1所示。戊唑醇和肟菌酯中基质效应最小的净化剂为弗罗里硅土，肟菌酸中基质效应最小的净化剂为PSA。为了在检测过程中降低基质效应对仪器的影响，在保证回收率的情况下，选择基质效应影响小的净化剂。因此，经过对基质效应的综合对比，选择弗罗里硅土作为净化剂。

2.4方法的准确度和精密度

本试验的准确度和精密度用添加回收率和相对标准偏差来衡量。称取5g空白的核桃样品，加入戊唑醇、肟菌酯及其代谢物肟菌酸标准品，其中戊唑醇的加标水平分别为5、50、500μg/kg，肟菌酯及其代谢物肟菌酸的加标水平分别为2、20、200μg/kg。对其进行样品前处理后测定，每个水平平行测定5次，计算加标回收率和RSD，结果见表2。在加标浓度范围内，戊唑醇的平均回收率为80. 3%～100. 8%，RSD为2.5%～11.7%;肟菌酯的平均回收率为91.1%～102.9%，RSD为1.7%～12.5%;肟菌酸的平均回收率为91.7%～101. 9%，RSD为3.7%～9. 2%，方法显示了良好的准确度和精密度，符合《农作物中农药残留试验准则》（NY/T 788-2018）的要求。其中在对照区中采集的样品空白的色谱图和戊唑醇、肟菌酯及肟菌酸加标色谱图见图3。

2.5线性相关性和定量限

使用核桃基质空白溶液配制1、5、10、50、100、500μg/L和1000μg/L的戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸标准溶液，按2.2前处理方法的选择中所确定的色谱质谱条件进行测定。在1～1000μg/L范围内，戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸的峰面积与质量浓度具有良好的线性关系（R²≥0. 9998），满足外标法定量检测的要求，其中线性回归方程及相关系数等参数见表1。以最小添加回收浓度确定3种目标化合物的定量限，其中戊唑醇的定量限为5μg/kg，肟菌酯和肟菌酸的定量限均为2μg/kg。

2.6实际样品的检测

在山西和河北按照《农作物中农药残留试验准则》开展最终残留试验，75%戊唑醇·肟菌酯水分散粒剂以推荐最高剂量112.5g/hm²（制剂用药量：稀释1000倍）在核桃成熟前倒推施药3次，每次间隔10d，核桃成熟期采集核桃。戊唑醇最终残留量为6～99μg/kg，肟菌酯最终残留量为<2～103μg/kg，肟菌酯的代谢物肟菌酸残留量均小于定量限（表3）。

3结论

本研究建立了在核桃基质中同时检测戊唑醇、肟菌酯和肟菌酯代谢物肟菌酸的一种简便可靠的残留分析方法。使用超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）能够对核桃基质样品中戊唑醇、肟菌酯和肟菌酯代谢物肟菌酸进行分析。实际样品检测中，戊唑醇最终残留量为6～99μg/kg，肟菌酯最终残留量为<2～103μg/kg，肟菌酯的代谢物肟菌酸残留量均小于定量限。样品前处理操作简单，对目标化合物选择性强，方法的线性范围、检测限、定量限、平均添加回收率及其相对标准偏差等性能指标均满足农药残留分析要求。