马钱子药材的HPLC 指纹图谱研究
2021-11-12杨红兵李锦周蒋代龙詹志来
杨红兵，李锦周，杨 佳，蒋代龙，詹志来，石 磊
（1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.中国中医科学院道地药材国家重点实验室/中药资源中心，北京 100700）
马钱子（Strychni semen）为马钱科植物马钱（Strychnos nux-vomicaL.）的干燥成熟种子，传统道地产地为印度，越南、缅甸、泰国等地也有生产［1-5］。马钱子味苦、性寒，有剧毒，其中马钱子碱和士的宁为其主要成分和有毒成分，具有通络止痛、散结消肿等功效。《中国药典》2020年版一部［6］马钱子项下有性状、鉴别（粉末显微与薄层色谱）、检查（水分、总灰分、黄曲霉毒素）、含量测定（马钱子碱、士的宁）等质控项目和指标，没有特征图谱。中药为多组分复杂体系，中药材的特征图谱（也称指纹图谱）能较为全面地反映中药所含化学成分的种类与数量，对药品质量进行整体描述和评价［7-13］。研究和建立中药材的指纹图谱已经成为中药质量控制的发展方向。本研究采用中药指纹图谱技术建立药材马钱子的HPLC 指纹图谱，为马钱子质量控制提供新方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品 马钱子碱、士的宁对照品购自成都普思生物科技股份有限公司，批号分别为CJ18B110、BF12B015。10批马钱子药材样品为印度进口，经作者鉴定，均为马钱科植物马钱（Strychnos nux-vomicaL.）的干燥成熟种子（表1）。甲醇、乙腈为色谱纯，浓盐酸、甲酸为分析纯，水为重蒸馏水。
表1 马钱子样品
1.1.2 仪器 LC20A 型高效液相色谱仪，软件工作站LabSolutions，检测器型号SPD-20A（日本岛津公司）；HX-30 型超声波清洗机（武汉恒信世纪科技有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相高效液相色谱柱。流动相：乙腈-水（0.2%甲酸）溶液。梯度洗脱，洗脱条件见表2，分析时间60 min。检测波长为254 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量5 μL。
表2 梯度洗脱条件
1.2.2 对照品溶液的制备［6］精密称取士的宁对照品6 mg、马钱子碱对照品5 mg，分别置于10 mL 量瓶中，加三氯甲烷适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取2 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL 含士的宁0.12 mg、马钱子碱0.1 mg 的对照品溶液。
1.2.3 供试品溶液的制备 取马钱子粉末0.6 g，置于50 mL 锥形瓶中，加甲醇-水-浓盐酸（50∶50∶1）溶液25 mL，称重后超声提取30 min，取出冷却后再称重，滴加提取液补足损失的重量，摇匀后静置，取上层清液，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，滤液作供试品。
1.2.4 参照峰的选择 比较对照品的保留时间和光谱图，对供试品色谱峰的归属进行分析，其中马钱子碱为马钱子的主要有效成分之一，出峰时间适中，与相邻峰分离较好，且峰面积较大，故定为参照峰，以计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
1.2.5 精密度试验 取同一供试品（S1）溶液，按色谱条件连续进样5 次，所得色谱图中各共有峰相对保留时间（RRT）的相对标准偏差（RSD）为0.078%～0.183%，相对峰面积（RA）的RSD为0.309%～2.273%，表明仪器精密度良好。
1.2.6 稳定性试验 取同一供试品（S1）溶液，按色谱条件分别于0、4、8、12、24 h 进行测定，各共有峰RRT的RSD为0.083%～0.263%，RA的RSD为0.385%～2.556%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。
1.2.7 重复性试验 取同一批药材（S1）样品5 份所分别制备的供试品溶液进行检测，色谱图中各共有峰RRT 的RSD为0.106%～0.376%，RA 的RSD为0.959%～2.722%，表明方法的重复性良好。
1.2.8 相似度计算 采用国家药典委员会编制的中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版计算相似度，并生成马钱子的对照用指纹图谱。
2 结果与分析
2.1 HPLC 指纹图谱相似度
马钱子碱、士的宁对照品色谱图见图1。10 批印度进口马钱子药材样品HPLC 色谱图比较见图2，并计算其色谱图相似度，马钱子药材的对照用指纹图谱见图3。由图2 可以看出，马钱子各样品间HPLC 色谱图中峰数、峰形、峰位（保留时间）等基本一致，峰高、峰面积或相对峰面积有所差异。由表3可以看出，样品间色谱图相似度以及与对照用指纹图谱的相似度均大于0.9，说明共有峰的保留时间或相对保留时间较为一致。
图1 马钱子碱、士的宁对照品色谱图（254 nm）
图2 10 批马钱子药材HPLC 色谱图（254 nm）
表3 10 批马钱子药材色谱图相似度计算结果
图3 马钱子对照用指纹图谱（254 nm）
2.2 指纹图谱的建立
药材马钱子提取物的所有色谱峰在60 min 内全部出现，记录60 min 色谱图即可。比较10 批供试品溶液的色谱图，确定6 个共有峰（特征峰），其中强峰3 个：1 号峰（未知成分）、4 号峰（马钱子碱）、5 号峰（士的宁）。以4 号峰作为参照峰，计算各共有峰相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RA），分别见表4、表5，结果符合指纹图谱要求。由表4、表5 可知，马钱子共有峰（特征峰，6 个）相对保留时间较为一致，RSD为0.207%～0.412%；而相对峰面积有所差异，与图2、表1 结果一致。
表4 10 批马钱子药材指纹图谱共有峰的相对保留时间
表5 10 批马钱子药材指纹图谱共有峰的相对峰面积
3 小结与讨论
利用HPLC 构建中药材的标准指纹图谱，为中药材的品质鉴定提供了新的有效方法。本研究表明，10 批印度产马钱子各样品间HPLC 色谱图相似度以及与对照用指纹图谱的相似度均较高。根据国家药典委员会编制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版”生成的对照用指纹图谱可作为印度产马钱子的标准指纹图谱。
不同产地的马钱子药材，HPLC 色谱有明显差异，其中10 批印度产品可以形成对照用指纹图谱，样品与对照指纹图谱之间的相似度大于0.9。其他产地如中国海南、云南等引种栽培的马钱子，与对照指纹图谱相似度较低。因此，对于市场上的马钱子商品，除指纹图谱以外，尚须利用性状鉴别、显微观察、含量测定等多种手段综合评判其真伪优劣。
