海豚源Kerstersia gyiorum的分离鉴定及生物学特性

魏诗谣，王丽扬，张信军，王彦红

(1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

Kerstersiagyiorum是一种革兰阴性菌，为产碱杆菌属成员。最初于2003年首次从人类的腿部伤口、痰液及粪便中分离出来，并通过细胞脂肪酸分析和16S rDNA基因测序鉴定[1]。根据目前已知的报道，人类感染病例包括慢性中耳炎[2]、下肢慢性伤口感染[3]、尿路感染[4]、慢性骨髓炎[5]等。Kerstersiagyiorum主要从人类下肢伤口中分离出来，迄今为止并没有充分资料表明此菌与某些疾病有关[6]。2019年，从我国东海采集的褐色海藻表面分离出Kerstersiagyiorum[7]，表明此菌存在于海洋环境中。2016年，报告了首例从动物身上分离出Kerstersiagyiorum，是从圈养的长江江豚气孔中分离出此菌[8]。2020年4月，本实验室从病死海豚的肝和肺等组织中分离出Kerstersiagyiorum，并对其进行初步分析，为圈养海豚诊断、防治此类细菌感染方面提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 生化鉴定管和药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司；琼脂粉，购自国药集团化学试剂有限公司；PCR反应试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 主要仪器 奥林巴斯CX系列生物显微镜(奥林巴斯工业有限公司，型号：CX21FS1C)；超净工作台(苏州净化工作台设备有限公司，型号：SW-CJ-IL)；恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司，型号：GNP9080)。

1.3 实验动物 清洁级BALB/c小鼠4只，雌雄各半，6周龄，购自扬州大学兽医学院比较医学中心。

1.4 病例背景 2020年4月，扬州某海洋馆1只雌性9岁海豚发生死亡，随即送至扬州大学动物医院进行死亡原因调查，通过对死亡海豚进行剖检，发现其心肌有较多散在的白斑，肺组织切面有大量结节(图1)，随后采集肝脏、肺脏和肾脏等内脏器官进行病原检测。

图1 海豚心脏和肺脏的组织病变

1.5 试验方法

1.5.1 细菌分离 将采集备用的海豚肝脏、肺脏和肾脏等病料经灭菌接种环无菌挑取后接种于绵羊血平板(含5%绵羊血)，置于恒温培养箱以37 ℃培养24 h，观察结果。24 h后挑取单菌落纯培养，将纯培养后的分离菌进行革兰染色镜检。

1.5.2 生化试验 用灭菌接种针挑取经纯培养后的单菌落接种于葡萄糖、乳糖、蔗糖、硝酸盐和鸟氨酸等一系列生化管，石蜡封口置于37 ℃恒温箱培养，48 h后查看结果。

1.5.3 16S rDNA序列分析法鉴定 无菌将分离菌株与去离子水混合后，采取煮沸裂解法制备DNA模板，按照宝生物工程(大连)有限公司生产的16S rDNA bacterial identification PCR kit说明书进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测部分扩增产物，剩余产物送至金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.5.4 致病性试验 小鼠分为攻毒组和对照组，每组雌、雄各1只，参考文献[9]中所用攻毒剂量，攻毒组小鼠腹腔注射0.2 mL菌液，菌液浓度为1×109CFU/mL，对照组注射等量生理盐水，观察结果。采集攻毒致死小鼠肝脏制作触片，美蓝染色观察病原形态。并挑取肝脏组织接种于绵羊血平板，观察培养的病原是否与分离菌一致。

1.5.5 药敏试验 采取药敏纸片扩散法检测分离菌株的药物敏感性，挑取纯化后的菌株均匀涂布在营养琼脂培养皿并贴上药敏纸片，18种药敏纸片包括美洛西林(75 μg/片)、复方新诺明(23.75 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)、环丙沙星(5 μg/片)、庆大霉素(10 μg/片)、丁胺卡那(30 μg/片)、诺氟沙星(10 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、多西环素(30 μg/片)、头孢曲松(30 μg/片)、多黏菌素B(300 U/片)、头孢哌酮/舒巴坦普生(75/75 μg/片)、左氧氟沙星(5 μg/片)、头孢噻肟(30 μg/片)、新霉素(30 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、链霉素(10 μg/片)和卡那霉素(30 μg/片)，置于37 ℃恒温箱培养24 h，根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)公布的最新抑菌药敏试验参照标准[9]进行判断。

2 结果

2.1 细菌分离 挑取死亡海豚肝脏、肺脏和肾脏组织无菌接种于绵羊血平板，24 h后各组织挑取物均分离出细菌，在绵羊血平板上长出灰白色、不透明、边缘整齐、中央略突起的中等大小菌落(图2)。将纯化后的分离菌进行革兰染色后，显微镜观察结果为革兰阴性球菌，呈单个或双个排列(图3)。

图2 海豚分离菌株菌落形态

图3 海豚革兰染色阴性球菌镜检结果(1 000×)

2.2 生化试验 将纯化后的分离菌株接种于生化管37 ℃培养48 h后，发现该菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、硝酸盐、鸟氨酸、七叶苷、赖氨酸脱羧酶、亚硝酸盐(产气)、精氨酸反应均为阴性，与文献[10]记载关于Kerstersiagyiorum的生化特性一致。

2.3 16S rDNA序列分析法鉴定 对分离菌的DNA模板进行16S rDNA的PCR扩增，电泳结果出现了500 bp左右的目的条带，测序结果经GenBank数据库比对，显示其与序列号HM117848.1的Kerstersiagyiorum具有100%同源性(图4)。

图4 16S rDNA序列比对结果

2.4 致病性试验 采取腹腔注射的方式攻毒，攻毒后6 h，攻毒组小鼠出现精神萎靡、颤栗、被毛粗乱的现象，18 h后卧伏不起、呼吸急促、食欲废绝，24 h左右死亡。对死亡小鼠剖检，见其肺脏出血、淤血，肝脏、脾脏略肿大，肝脏边缘有出血点，肾脏色淡，胃和小肠段充满黄色液体，肠道液化易破损(图5)。采集攻毒致死小鼠肝脏制作触片，美蓝染色后可在显微镜下观察到单个球菌(图6)，与分离菌显微形态一致，随后挑取肝脏组织接种于绵羊血平板，可见到白色、不透明菌落(图7)，与分离菌培养形态一致。

图5 小鼠组织病变结果

图6 小鼠肝触片美蓝染色镜检结果(1 000×)

图7 小鼠肝组织分离菌株菌落形态

2.5 药敏试验 试验结果表明，分离菌仅对诺氟沙星和环丙沙星耐药，对美洛西林、复方新诺明和氟苯尼考等16种抗菌药敏感。

3 讨论

从送检海豚的肝脏、肺脏和肾脏组织分离出菌株,通过常规细菌分离培养及生化试验，16S rDNA序列分析鉴定为Kerstersiagyiorum。致病性试验发现，试验组小鼠典型的临床症状为呼吸急促，呼吸频率比较高。剖检小鼠发现其肺部多处密布小出血点，部分肺脏组织淤血。在剖检海豚时发现其肺组织切面有大量结节。在人类患者感染Kerstersiagyiorum的病例中，报道过1例患有呼吸机依赖性慢性呼吸衰竭病史的患者在住院期间，气管脓性分泌物增多，检查发现其患有支气管炎，对其进行小支气管肺泡灌洗，灌洗液中分离出此菌[11]。小鼠感染Kerstersiagyiorum后呼吸急促的症状显著，Kerstersiagyiorum侵袭宿主呼吸系统相关机制的研究有待深入。此外，剖检试验组小鼠还发现其胃肠道液化严重，胃内有大量黄色黏稠液体，胃肠壁薄弱易碎，几乎透明，说明Kerstersiagyiorum对宿主的消化系统有较强的攻击性。

Kerstersiagyiorum对多种抗菌药保持敏感性，如市面上常见的阿莫西林、庆大霉素、左氧氟沙星等。此菌对诺氟沙星和环丙沙星耐药，诺氟沙星和环丙沙星均属于氟喹诺酮类抗菌药。Kitagawa等[12]、Pence等[13]和Uysal 等[14]进行的药敏试验结果也显示，Kerstersiagyiorum对氟喹诺酮类抗菌药产生耐药性。一般来说，此类药物对革兰阴性杆菌较为有效。推测因为Kerstersiagyiorum不是常见菌，接触各类抗生素的时间较少，所以耐药性较弱。本次药敏试验结果可作为治疗Kerstersiagyiorum感染的参考依据。