蛹虫草多糖对微波辐射损伤雄性小鼠生殖功能的影响

高俊涛，冯宪敏，万 朋，骆晓峰，朱文赫，徐俊杰，田洪艳，吕士杰

(吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林 132013)

微波辐射对机体功能产生危害[1-3]，特别是导致雄性精子发育及生殖功能异常[4]，目前对微波辐射引起的雄性生殖功能损伤尚缺乏特效的防治方法，蛹虫草多糖具有减轻双酚A导致的生殖功能损伤作用[5]。本试验分别从小鼠性行为能力和氧化应激水平等方面来研究蛹虫草多糖减轻微波辐射致小鼠生殖功能损伤作用，为研究微波辐射对生殖系统的影响及防治措施提供思路和方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 辐射仪(大功率微波雷达发射机改装而成的微波发射机)；Hitachi 7600生化分析仪；BA300型数码生物显微镜；酶标仪；MuseTM细胞分析仪。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)检测试剂盒，睾酮(Testosterone，TTE)酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒，均购自南京建成生物技术研究所(批号依次为：20180610、20180613、20480611和20180620)。蛹虫草多糖的制备：称取5 g蛹虫草的基质粉末，加入200 mL水，摇匀，再加入2 000 U的纤维素酶2.5 mL，调节pH到4.8，50 ℃水浴1.5 h，再转移到80 ℃水浴中灭酶处理2 h，然后再进行超声波处理，30 ℃处理40 min，4 200 r/min离心10 min，收集上清糖液。将收集到的糖液旋转蒸发到一定体积，采用Sevag法除蛋白，除蛋白后的糖液采用4 倍体积的95%乙醇进行醇沉，在4 ℃冰箱中醇沉24 h，经抽滤、冷冻干燥得到蛹虫草多糖(Cordyceps militaris polysaccharide，CMP)。

1.2 试验分组与处理 选择清洁级昆明小鼠75只，雄性，体重(18±2)g，由吉林大学实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(吉)2016—0002。实验动物随机分为5组，即对照组、模型组、蛹虫草多糖低、中、高剂量组，每组15只。模型组和各蛹虫草多糖组进行10 mW/cm2微波照射，时间60 min，1次/d，共30 d。将对照组小鼠每天在同一时间放置于微波辐射源喇叭口正上方60 min，但不进行微波照射，共30 d。最后1次照射后6 h进行小鼠性行为能力测试。各蛹虫草多糖组于最后1次照射后12 h，以低[10 mg/(10 g·bw)]、中[20 mg/(10 g·bw)]、高[40 mg/(10 g·bw)]剂量蛹虫草多糖提取物，按0.3 mL/(10 g·bw)灌胃，1次/d,连续灌胃30 d，模型组和对照组小鼠给予等体积生理盐水，最后1次灌胃后6 h进行小鼠性行为能力测试，12 h后取材。

1.3 性行为能力的观察 参照Anders[6]方法进行，雄性小鼠的第1次扑捉时间即扑捉潜伏期(CIP)，同时观察雄性小鼠在30 min内对雌性小鼠的扑捉次数(CT)。

1.4 精子相对计数测定 小鼠处死，雄性小鼠冰浴下取睾丸、附睾。睾丸称重，计算睾丸指数，附睾37 ℃ 孵育、游离精子、过滤得精液，涂片经固定、染色后在显微镜下计数精子数。

1.5 精子畸形率测定 附睾组织悬液涂片，干燥12 h，伊红染色，高倍镜下观察精子畸形。每组随机视野计数1 000个精子，记录畸形精子数量，计算精子畸形率。

1.6 精子存活率测定 收集细胞使用MuseTM细胞分析仪检测精子死亡率，计算精子存活率。

1.7 血清SOD、GSH-Px、MDA和TTE检测 小鼠眼球摘除取血，离心，分离血清备用待测。依照试剂盒说明书要求测定血清中SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量，ELISA法检测小鼠血清中TTE含量。

2 结果

2.1 蛹虫草多糖对微波辐射雄性小鼠性行为的影响 与对照组比较，微波辐射30 d后小鼠的CIP显著延长、CT显著减少(P<0.05)。与模型组比较，蛹虫草多糖中剂量组(P<0.05)、蛹虫草多糖高剂量组(P<0.01)的CIP显著缩短，CT显著增加(P<0.05)(表1)。

表1 各组小鼠CIP、CT比较

2.2 蛹虫草多糖对微波辐射雄性小鼠精子的影响 与对照组比较，微波辐射30 d后小鼠的精子相对计数明显减少(P<0.05)，精子畸形率明显增加(P<0.05)。与模型组比较，蛹虫草多糖中剂量组(P<0.05)、蛹虫草多糖高剂量组(P<0.01)精子相对计数显著增加，精子畸形率显著减少(P<0.05)(表2)。各组小鼠精子形态见图1。

表2 各组小鼠精子相对计数、畸形率、精子存活率比较

图1 小鼠精子形态(400×)

2.3 蛹虫草多糖对微波辐射雄性小鼠血清中SOD和GSH-Px活性、MDA和TTE含量的影响 与对照组比较，微波辐射小鼠的SOD、GSH-Px的活性、TTE水平显著降低(P<0.05)，MDA的含量显著增加(P<0.05)。与模型组比较，蛹虫草多糖中、高剂量组SOD、GSH-Px的活性、TTE水平显著增加(P<0.05)，MDA的含量显著降低(P<0.05)(表3)。

表3 各组小鼠血清SOD和GSH-Px活性、MDA和TTE含量比较

3 讨论

蛹虫草多糖是蛹虫草中含量最多的药理活性物质，是一类高分子复合物，具有抗肿瘤[7]、抗氧化[8]、降血糖[9]、降血脂[10]、提高免疫力[11]等作用，而蛹虫草多糖对微波辐射所致的雄性生殖系统损伤的研究少有报道。微波辐射导致机体缺血缺氧并产生过量的氧化自由基，最终导致多器官功能障碍[12-13]。微波辐射对雄性生殖系统产生不良的影响，易出现过热而造成睾丸损伤。本试验表明，持续微波辐射环境可引起精子活动力下降，畸形率增加，存活率降低等。研究表明，微波辐射能够引起代谢改变，从而影响雄性生殖系统。微波辐射过程中睾丸和生精细胞产生的过氧化物与精子的生理功能有关[14-15]。过氧化伤害引起精子膜脂质过氧化，导致雄性不育。MDA是过氧化脂质的分解产物，可反映体内自由基产生的程度。SOD、GSH-Px反映机体的抗氧化能力。本试验结果表明，微波辐射可以导致精子的相对数量减少而精子的畸形率增加，模型组小鼠血清SOD、GSH-Px的活性、TTE水平均较对照组降低而MDA含量显著升高，蛹虫草多糖能够提高精子的相对数量、精子存活率、血清SOD和GSH-Px的活性、TTE水平，降低精子的畸形率、MDA含量，上述结果提示，蛹虫草多糖能改善微波辐射对雄性小鼠生殖系统的影响，其作用机制可能与减轻生殖细胞的氧化损伤有关。