基于生物信息学探讨骨质疏松症与肌少症的关系

商海滨 廉由之 郭海玲 杨光月 邓真 艾有利 陈蓓 李国中 赵咏芳*

1.上海市宝山区中西医结合医院 上海中医药大学附属曙光医院宝山分院，上海 201999 2.上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心，上海 201203 3.上海市中医药研究院骨伤科研究所，上海 201203

世界卫生组织(World Health Organization，WHO)提出“健康老龄化”的概念，不仅要求寿命延长，更要求寿命质量的提高。肌少症(sarcopenia)可导致肌肉量及肌肉强度下降，骨质疏松症(osteoporosis)可引起骨量及骨骼功能的下降，严重影响了老年人的生活质量。由于目前对于肌少症的相关研究仍处于初步阶段。若探寻到骨质疏松症与肌少症的共同发病机制，那对于骨质疏松症与肌少症的治疗将起到事半功倍的效果。鉴于骨质疏松症与肌少症均为多基因通路调控，涉及多器官、多系统、多靶点的全身代谢性疾病。利用分子生物学技术，通过多组基因数据整合分析，探讨骨质疏松症并发肌少症的发病机制具有极为重要的现实意义，这将为同时治疗两种疾病的药物的精确研究提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 数据库与软件

CTD数据库[1]、Disgenet数据库[2](2020年V7.0版)、TTD数据库[3]、OMIM 数据库[4]、GeneCards数据库[5]、Drugbank数据库[6]、KEGG数据库[7]，STRING网站[8]，Perl软件、R语言软件，UniProt知识库，Cytoscape 3.7.2软件[9]。

1.2 方法

分别以“Osteoporosis”、“Sarcopenia”为关键词，检索目前公认的主要的疾病数据库来获得骨质疏松症与肌少症相关靶点，其中包括CTD、Disgenet、TTD、OMIM、GeneCards、Drugbank、KEGG数据库。分别获得影响该疾病的靶点基因。随后，将所获得靶点分别进行汇总、筛选、去重后即得到该疾病的靶点基因。利用R语言软件将Osteoporosis靶点基因与Sarcopenia靶点基因取交集，得到Osteoporosis-Sarcopenia共同靶点基因，利用STRING网站对Osteoporosis-Sarcopenia共同靶点基因进行蛋白互作网络分析，并进行基因GO富集分析和KEGG通路分析。

2 结果

2.1 基因筛选结果

CTD数据库中骨质疏松症和肌少症相关基因分别为807和113个；Disgenet数据库中1 098和164个；TTD数据库中24和0个；OMIM数据库中69和4个；GeneCards数据库中346和200个；Drugbank数据库中24和0个；KEGG数据库中13和0个。汇总数据、删除重复基因，最终得到骨质疏松症相关基因1 782个，肌少症相关基因429个。

2.2 两种疾病靶点的交集分析

利用R语言软件将Osteoporosis靶点基因与Sarcopenia靶点基因取交集，得到Osteoporosis-Sarcopenia共同靶点基因共计171个，形成两种疾病靶点基因的韦恩图(见图1) 。其中，骨质疏松症与肌少症的共同靶点基因，见表1。

表1 骨质疏松症与肌少症的共同靶点基因列表Table 1 The list of the common target genes of osteoporosis and sarcopenia

图1 骨质疏松症与肌少症的共同靶点基因的韦恩图Fig.1 Venny diagram of the common target genes of osteoporosis and sarcopenia

2.3 靶点基因/蛋白互作网络分析

利用STRING网站对Osteoporosis-Sarcopenia共同靶点基因进行蛋白互作网络分析，其中，置信度设置为0.90，隐藏独立靶点，形成了蛋白互作网络分析的(详见图2)PPI分析图(左)并利用R语言软件计算得到barplot图(右)。由于靶基因之间的节点数目反映该基因在此过程中发挥作用的强弱，AKT1、PI3K在骨质疏松症和肌少症发病过程中可能发挥了重要作用。

2.4 GO分析与Pathway富集分析

本研究采用了cluego插件，对骨质疏松症与肌少症以及共同靶点基因中的关键靶点及信号通路进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。其中，节点的大小代表了该信号通路的显著性，信号通路的显著性越高，节点越大，说明该通路的重要性越高。其中，骨质疏松症GO分子功能富集分析见表2左侧，肌少症GO分子功能富集分析见表2右侧，共同靶点基因GO分析结果见图3。在KEGG通路富集分析过程中，其中，骨质疏松症KEGG通路富集分析见表3左侧，肌少症KEGG通路富集分析见表3右侧，共同靶点基因KEGG通路富集分析结果见图4。

注：左 PPI分析图；右 barplot图图2 骨质疏松与肌少症共同靶点基因的蛋白互作网络分析的Fig.2 The PPI plot (left) and bar plot (right) of protein interaction network analysis of the common target genes of osteoporosis and sarcopenia

表2 骨质疏松症与肌少症各自GO分子功能富集分析结果表Table 2 Results of GO enrichment analysis of osteoporosis and sarcopenia

续表2

图3 骨质疏松症与肌少症共同靶点GO分析结果图Fig.3 Results of GO analysis of the common targets of osteoporosis and sarcopenia

表3 骨质疏松症与肌少症各自靶点KEGG通路富集分析结果列表Table 3 The list of KEGG pathway analysis results of the common targets of osteoporosis and sarcopenia

图4 骨质疏松症与肌少症共同靶点KEGG通路富集分析结果Fig.4 Enrichment analysis results of KEGG pathway of the common target of osteoporosis and sarcopenia

3 讨论

2019年亚洲肌少症工作组(Asian Working Group for Sarcopenia, AWGS)最新共识[10]指出，亚洲老年肌少症的患病率在5.5 %至25.7 %之间，而中国疗养院中老年肌少症患病率在31.4 %以上[11]。骨质疏松症和肌少症均为增龄性疾病，2013年，Binkley[12]提出将肌少症伴有骨质疏松症作为一种疾病——“活动障碍综合征”(dysmobility syndrome)。本病可导致老年人机体平衡能力下降，易跌倒发生脆性骨折，最终导致老年人的生活质量降低[13]。2018年中国与欧洲在骨质疏松与肌少症的诊断、治疗方面进行了相互交流[14]，但尚未有明确结果。本研究基于生物信息学以及现代大数据信息技术，通过检索大型疾病数据库并进行综合分析，最终使骨质疏松症与肌少症之间的共同靶点基因信息可视化。

图表分析可知，骨质疏松症主要涉及PI3K-Akt、MAPK、Ras、Rap1、TNF、cAMP、JAK-STAT、FoxO、Chemokine、NOD样受体以及HIF-1等信号通路。其中多数通路已被广泛研究。如本研究中靶基因数最多的通路为PI3K-Akt信号通路，以往研究表明该通路与成骨和破骨通路紧密联系，调控着成骨细胞和破骨细胞存活、分化过程从而维持骨量和骨转换平衡[15]。朱云艳等[16]发现，Toll样受体通路过表达可引起MAPK以及Akt 磷酸化水平的下降。田爱现等[17]在骨质疏松关联性分子信号通路的论述中，PI3K-Akt、TNF等多种信号通路均有涉及。李近等[18]综合分析认为FoxOs可调节骨形成和骨吸收的动态平衡进而影响骨组织的微结构和骨质量。钟航等[19]认为绝经后骨质疏松症中破骨细胞内HIF-1信号通路的上调可能与Akt、ERK等信号通路有关。肌少症主要涉及PI3K-Akt、JAK-STAT、MAPK、长寿调控、FoxO、AMPK、Insulin、HIF-1、mTOR等信号通路。多数通路已被广泛研究，但关于具体信号通路与肌少症如何发病的相关研究较少。杨明等[20]认为肌少症与IGF/PI3K/Akt/mTOR信号通路，维生素D及多种激素均有密切关系，但关于肌少症相关的信号通路的研究仍有待进一步深化。

我们分析得到骨质疏松症与肌少症的部分信号通路是重叠的，这表明两种疾病之间可能存在共同的发病机制。其主要包括PI3K-Akt、长寿调控、FoxO，AGE-RAGE、HIF-1、AMPK、JAK-STAT、MAPK、Insulin、TNF以及Apoptosis过程。已有研究提示，在PI3K/Akt通路中，IGF-1通过PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路激活IGF-1R[21]。IGF-1可诱导肌肉肥大，进而促进骨骼发育和骨量的保存，然而GH的缺乏则会导致肌肉和骨量减少。同时，血清IGF-1水平与瘦体量和骨折风险降低呈正相关。Demontiero等[22]的研究表明肌少症与骨质疏松症患者的IL-6 和TNF-α水平较高相关。由于肌肉和骨骼组成人体的肌骨运动系统，两者紧密关联。肌肉是调节骨骼潜在细胞、信号的重要来源，骨骼的内分泌或旁分泌作用可调控肌肉发育、肌量与肌力。骨质疏松症与肌少症均为复杂代谢性疾病，涵盖众多差异表达基因，均拥有庞大的疾病基因表达网络，涉及众多信号通路，并且网络之间密不可分。对于这两种疾病的防治应针对骨骼和骨骼肌之间的相互关系和共同作用靶点，运用综合有效的干预措施。

本研究拟探寻骨质疏松症与肌少症疾病过程中存在的高度重合的差异基因表达以及相关信号通路，进而针对共同靶点或通路进行调控，为临床治疗骨质疏松症与肌少症提供理论依据。当然，本研究存在一定弊端，基因的正向负向调控表达与激活程度未在数据库中显示，这需要生物信息学以及疾病数据库后续的不断完善。同时，本研究结果仍需要后续进一步实验验证与支持，使理论更加可靠。