m6A对BMSCs的分化及骨质疏松症的调节作用

袁国栋 孙中洋 王宇翔 鱼鑫 赵建宁 许斌*

1.东南大学医学院医学院，江苏 南京 210009 2.东部战区总医院骨科，江苏 南京 210002

世界卫生组织定义骨质疏松是一种以骨量低下、骨微结构损坏而导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病[1]，美国国立卫生研究院(NIH)提出骨质疏松症的两个特征是骨强度下降和骨折风险增加。骨强度反映骨骼的两个方面即骨密度和骨质量。骨质疏松的严重后果是发生骨质疏松性骨折(脆性骨折)，即在受到轻微创伤或日常活动中即可发生骨折。骨质疏松性骨折的常见部位是脊椎、髋部和前臂远端。骨质疏松是一种退行性疾病，随年龄的增长患病风险增高。我国是世界上老年人口绝对数量最多的国家，随着人民寿命延长和老龄化社会的到来，骨质疏松已经成为我国社会的重要健康问题。

1 m6A

N6-甲基腺苷(m6A)是位于腺苷N6位点的一种动态甲基化修饰，其于二十世纪七十年代被首次发现，是真核生物mRNA中最普遍的内部修饰。m6A多位于3′非翻译区(3′UTR)，在终止密码子附近富集，CDS区(编码区)也有分布[2-3]。m6A修饰位点有一定的序列特征，通常为DR m6A CH(D=A、G或U；R=G或A；H=A、C或U)。m6A修饰过程发生于核斑点，影响着mRNA代谢过程的各个阶段如mRNA的剪接[4]、结构转换[5]、转运[6]、翻译[7-10]和降解[11](图1)。除mRNA外，m6A修饰还对非编码RNA[如miRNA[12]、lncRNA[16]，rRNA[13]、tRNA[14]、snRNA(核小RNA)[15]等]具有重要的调节功能，比如pri-miRNA(初级miRNA)上的m6A修饰可推动其加工成pre-miRNA(miRNA前体)和成熟的miRNA。一些lncRNA上也存在m6A如Malat1、Neat1、Hotair、XIST(X染色体失活特异转录物), XIST上的m6A修饰可促进XIST介导的X染色体失活[16]。m6A由m6A甲基化转移酶复合物催化形成，甲基的供体是S腺苷甲硫氨酸(SAM)，该复合体由甲基转移酶3(METTL3)、甲基转移酶14(METTL14)、Wilms瘤1相关蛋白(WTAP)[17]、Vir样m6A甲基转移酶相关蛋白(KIAA1429 / VIRMA)[18]、含CCCH结构域的锌指蛋白13(ZC3H13)[19]、HAKAI(一种E3泛素连接酶)[20]、RNA结合基序蛋白15(RBM15)及其旁系同源蛋白RBM15B[21]共同组成。在m6A甲基化转移酶复合物中，METTL3和METTL14形成一个异二聚体[22-23]，其中METTL3有催化活性，而METTL14在结构上对METTL3起到支持作用。m6A甲基转移酶的其余组成成分则通过直接或间接与异二聚体的相互作用起到“writer”的作用，而各个蛋白是否具有其特定的功能有待进一步研究。Alkb家族蛋白的两个成员FTO和ALKBH5是m6A的“eraser”，正如它的命名一样，FTO(脂肪和肥胖相关基因)最开始被人们熟知是因为其是脂肪形成和肥胖中的关键基因。2011年美国芝加哥大学何川教授团队首先发现FTO是一个m6A的“eraser”，而正是这个发现让人们认识到m6A有着动态调控机制。但是，最新的研究表明FTO对m6Am去甲基化活性高于m6A[24]，所以有学者认为实际上ALKBH5是主要的m6A的“eraser”。m6A对mRNA代谢过程的调控是通过m6A的“reader”蛋白识别m6A位点继而发挥相应功能实现的，“reader”蛋白主要包括YTHDF1-3和YTHDC1-2，它们都是YTH结构域家族蛋白。YTHDF1可以调节mRNA的翻译[7]，YTHDF2介导mRNA的降解[25]，而YTHDF3同时具备这两种功能[26]。另外，METTL3也有“reader”的功能，其可以促进翻译[9]。YTHDC2在睾丸中富集，在精子形成过程中起重要作用并可以促进mRNA的翻译[27]。而作为核内的“reader”，YTHDC1有促进mRNA剪接和出核的功能[4,6]。m6A在许多疾病和病理生理过程中起着至关重要的调节作用如肿瘤发生[28]、白血病[29]、心肌重塑[30]、胚胎发育[31]、HSC(造血干细胞))分化等[32]。越来越多的证据表明，m6A对BMSCs的分化具有重要的调节作用，m6A代谢的紊乱也可能是骨质疏松症的潜在发病机制。在本文中，我们总结归纳了有关m6A与BMSCs分化以及骨质疏松症的关系的最新研究成果，提示m6A可能是骨质疏松症潜在的治疗靶点。

图1 存在m6A的mRNA的代谢过程Fig.1 Metabolic process of mRNA with m6A

2 m6A调节BMSCs成脂分化与成骨分化之间的转换

骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，能促进间充质组织的再生如骨、脂肪、软骨、肌肉、韧带、肌腱等。临床研究表明，肥胖与骨质疏松症经常并存，并可能有因果关系[33-35]，而骨质疏松症的一个重要特征便是脂肪组织在骨髓中的积累。Wu等[36]发现在BMSCs中条件敲除METTL3会导致小鼠骨量的降低以及骨髓中脂肪组织的积累，而从小鼠骨髓中分离出的BMSCs成脂分化潜能增加，成骨分化潜能降低。在机制上，Yao等[37]的研究表明METTL3是通过JAK1/STAT5/C/EBPβ通路抑制BMSCs成脂分化的，在这项研究中，研究人员发现METTL3与JAK1的表达呈负相关，其中YTHDF2参与了这个过程，其促进了JAK1的mRNA的降解，进而激活JAK1/STAT5/C/EBPβ通路。Shen等[38]研究发现GDF11-FTO-PPARγ通路可以促进BMSCs的成脂向分化。FTO的mRNA水平在BMSCs成骨向分化过程中下降而在成脂向分化中上升。在成骨细胞中条件敲除FTO可以缓解小鼠OVX(去卵巢)造模造成的骨小梁减少，骨小梁分离度增大等表型，而敲除FTO本身并不会使成骨功能指标上升。另外，与对照OVX小鼠相比，从敲除FTO的OVX小鼠骨髓中分离出的BMSCs成脂分化潜能降低，成骨分化潜能增加。在FTO的上游调控机制上，Li等[39]报道miR-149-3p可以靶向FTO进而起到调节BMSCs成脂分化与成骨分化之间的转换的作用。综上所述，BMSCs中的m6A修饰在调节其成骨分化和成脂分化之间的转换中发挥着重要作用，METTL3促进BMSCs成骨向分化，抑制其成脂向分化而FTO则相反。

3 m6A调节BMSCs成骨向分化的机制

多种信号通路调节着BMSCs的成骨向分化如Wnt/β-catenin通路、MAPK通路、BMPs/Smad通路、PI3K-Akt通路、Notch通路等，而m6A修饰可以通过改变这些通路中的重要分子的表达水平而参与对BMSCs的成骨向分化的调控。Tian等[40]报道在BMSCs成骨向分化过程中METTL3的表达增加。在机制上，该团队发现敲低METTL3通过抑制PI3K-Akt通路从而阻遏了BMSCs细胞的成骨向分化。VEGF(血管生成因子)与成骨细胞的成熟有关，研究人员发现METTL3可以影响VEGF的mRNA的剪接，在BMSCs中敲低METTL3后，剪接体VEGF-188的mRNA表达水平降低而VEGF-120没有明显变化，而有文献报道前者参与了BMSCs成骨向分化的过程。PTH(甲状旁腺素)能调节骨代谢和骨稳态，有研究报道PTH可以通过Notch信号通路调控BMSCs向成骨细胞分化。PTH1r(甲状旁腺素1型受体)对PTH的功能至关重要，一种治疗老年女性绝经后骨质疏松的新药阿巴洛肽的药理机制便是选择性激活PTH / PTH1r信号轴，在上文提到的Wu等的研究中发现PTH / PTH1r信号轴是METTL3促进BMSCs成骨向分化的下游通路。该研究中发现在BMSCs条件敲除METTL3抑制了PTH1r的翻译。不过，研究人员没有进一步探索是哪个m6A的“reader”介导了这个过程。Yan等[41]通过MeRIP芯片测序在敲低METTL3的BMSCs中筛选出了有显著变化的pri-miRNA和pre-miRNA，在这其中pre-miR-320的m6A水平最高因而研究人员关注了这个miRNA，进一步研究发现敲低METTL3使pre-miR-320和miR-320的表达升高而miR-320可以直接靶向BMSCs成骨向分化的重要转录因子Runx2继而抑制其成骨向分化，而敲除METTL3本身也可使Runx2的mRNA和蛋白水平降低，YTHDF1介导了这个过程。因此作者总结METTL3可以通过上述两种机制调节BMSCs的成骨向分化。但是，据报道pri-miRNA上的m6A被“reader”蛋白HNRNPA2B1(异质性胞核核糖核蛋白A2B1)识别后可促使其加工成pre-miRNA和成熟的miRNA[42]，所以METTL3实际上是参与了miRNA的成熟过程，而这无法解释上述研究中敲低METTL3后pre-miR-320和miR-320的mRNA水平升高的现象，其内在的机制有待进一步研究。综上所述，m6A可以通过多种机制调节BMSCs的成骨向分化。

4 m6A调节骨质疏松症的发生

骨质疏松症可以发生在不同性别和任何年龄，但多见于绝经后妇女和老年男性。原发性骨质疏松症分为绝经后骨质疏松症(I型)、老年性骨质疏松症(Ⅱ型)和特发性骨质疏松症(包括青少年型)3类。其中，绝经后骨质疏松症一般发生在妇女绝经后5～10年内；老年性骨质疏松症一般指老年人70岁后发生的骨质疏松。多项研究表明m6A可能参与了这两种骨质疏松症的发生过程。早期的临床研究报道FTO基因的常见变异与骨密度(BMD)以及女性髋部骨折风险相关[43-44]。Gregor等[45]构建了点突变的FTO基因的小鼠模型(FTO-R313A)，突变点位于精氨酸-313，其对FTO的酶活性至关重要。研究人员发现FTO-R313A小鼠的身长、体重、脂肪质量、瘦肉质量与野生型小鼠相比较小而身体成分的比例未发生明显变化。不过，FTO-R313A小鼠的BMD和骨矿物质量(BMC)都有下降，因此FTO对骨骼生长和骨矿化有重要作用。Zhang等[46]则构建了FTO全敲除的小鼠模型(FtoKO)，在12周和30周时小鼠都呈现与上述研究相似的表型。除此之外研究人员同时构建了在成骨细胞中条件敲除FTO的小鼠模型(FtoOc KO)，他们发现FtoOc KO小鼠的身长、体重等指标较野生型小鼠没有明显改变，12周时骨量也没有明显变化。而在30周时，FtoOc KO小鼠的骨量才显著降低，这提示FTO可能参与了Ⅱ型骨质疏松症的发生过程而FtoKO小鼠的骨表型可能一部分是小鼠新陈代谢的改变造成的。前文提及Shen等的研究中FtoOc KO小鼠和野生型小鼠的骨表型则没有明显差异，与以上两个研究结果相悖，基于该研究小鼠骨表型的数据不够全面，说服力较弱。值得一提的是，Zhang等的研究中作者发现FTO的mRNA水平在原代成骨细胞分化过程中升高而在Shen等的研究中提到FTO的mRNA水平在BMSCs成骨向分化过程是下降的。BMSCs是原代成骨细胞的前体细胞，因此原代成骨细胞应当是BMSCs成骨向分化的一个阶段。因此，FTO可能在BMSCs不同的分化阶段发挥着不同功能：在BMSCs分化前期调节其成脂分化与成骨分化之间的转换而在其成骨向分化后期起到促进成骨向分化的作用。不过，FTO功能发生变化的时间点以及功能转变的内在的机制尚不清楚。Wu等的研究中用CRISPR-Cas9技术分别构建了在BMSCs中条件敲除和敲入METTL3的模型小鼠(Mettl3KO和 Mettl3KI)。Mettl3KO小鼠骨量减少，呈现骨质疏松症的骨表型而METTL3敲入则可以缓解由于小鼠OVX造模所致的骨量丢失，这提示METTL3可能调控了Ⅰ型骨质疏松症的发生。另外，研究者还注意到METTL3的敲除也使得破骨细胞功能上升而在Mettl3KI小鼠中则没有改变。Yan等发现骨质疏松病人骨组织的总体m6A水平下降且METTL3和METTL14的mRNA水平降低而FTO和ALKBH5无明显改变。在这项工作中，研究人员构建了整体敲除和过表达METTL3的模型小鼠而得到了和上述研究相似的结果。综上所述，虽然METTL3和FTO分别是m6A的“writer”和“eraser”，看似作用相悖，但它们都对骨形成有重要作用，在骨质疏松症的发生过程中扮演着重要角色。

5 总结与展望

目前来看，在骨质疏松症领域m6A相关的研究较少且都集中在m6A对BMSCs和成骨细胞成骨向分化的调控机制上。m6A是通过调节哪些下游分子的表达从而参与骨质疏松症的发生还不明晰，所以未来还应该开展更多的相关研究完善m6A调控骨质疏松症发生的机制。最近的一项研究[47]报道METTL3对破骨细胞的分化和骨吸收功能也有调节作用。这样的结果并不让人意外，因为m6A在真核细胞mRNA中十分常见，调控过程也极其复杂。m6A在不同的病理生理过程中可能影响着不同的关键正向或负向调节因子mRNA或蛋白水平的表达，因此同一个m6A的“writer”、“eraser”或“reader”很有可能同向调控两个作用相反的病理生理过程。我们认为未来在m6A对骨质疏松症调节机制的研究上不应局限于METTL3和FTO，其他m6A的“writer”、“eraser”或“reader”或许也会通过不同途径参与骨质疏松症的发生。总之，m6A对BMSCs分化和骨质疏松症有重要的调节作用，m6A可能是治疗骨质疏松症的潜在靶点。