右归丸对骨性关节炎模型大鼠TGF-β1/Smads信号通路的影响

刘洋 孙权 杨砥 秧荣昆 徐远坤

贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550002

中医认为骨性关节炎属于痹症与痿证，肝肾亏虚、长期劳损与外感风寒湿邪为其主要病机。右归丸出自《景岳全书》，主要成分有熟地黄、附子(炮附片)、肉桂、山药、山茱萸(酒炙)、菟丝子、鹿角胶、枸杞子、当归、杜仲(盐炒)，具有温阳补肾、填精补髓之功效。研究证实，右归丸对骨性关节炎具有治疗作用，可通过抑制基质金属蛋白酶活性和炎症因子表达来抑制软骨退变[1]，但其对骨性关节炎的作用机理仍需要探讨。

国内外的研究主要从细胞因子、免疫反应及基质金属蛋白酶等几方面探讨骨性关节炎的发病机制，但尚未形成统一的观点[2-4]。近年来，人们将研究的重点集中到对软骨生物学标志物的研究，同时与其相关的细胞信号转导通路也成为探讨骨性关节炎发病机制的重要手段。目前的研究证实 Smad 转导的 TGF-β家族信号可以通过多种机制对软骨细胞的增殖、分化和成熟进行精密调控[5-6]。本研究采用经典的Hulth法建立膝骨性关节炎模型，并给予右归丸灌胃干预，进一步探讨右归丸对骨性关节炎软骨的保护作用及可能的作用机理。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

右归丸购自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂(国药准字Z11021040，批号11030027)，由熟地黄 24 g、山药 12 g、山茱萸 9 g、枸杞子 9 g、鹿角胶 12 g、菟丝子 12 g、杜仲 12 g、当归9 g、肉桂 6 g、制附子 6 g 等组成。换算成大鼠用量为：111 g ×0.018×5≈10 g/kg，以此为中剂量，预实验比较了5、10、20 g/ kg的治疗效果，其中20 g/kg治疗效果最好，所以实验选择了此浓度进行实验；TGF-β/Smad通路抑制剂(SB431542，批号：SF7890，碧云天生物技术有限公司)；肿瘤坏死因子α ELISA检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，批号：ARB13479)；白细胞介素1β ELISA检测试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司，批号：SBJ-R0024)；兔抗鼠COL-Ⅱ多克隆抗体(武汉云克隆科技股份有限公司，批号：PAA572Rb51)；兔抗鼠MMP-13多克隆抗体( 上海生工生物工程股份有限公司，批号：D120098-0025)；兔抗鼠TGF-β1(武汉菲恩生物科技有限公司，批号：FNab08638)；兔抗鼠Smad2(武汉菲恩生物科技有限公司，批号：FNab07993)；(武汉益普生物科技有限公司，批号：ATA37717)；兔抗鼠p-Smad2(上海信裕生物科技有限公司，批号：IC195026)；兔抗鼠p-Smad3(上海钰博生物科技有限公司，批号：IC187103)。

1.2 实验动物

成年SD大鼠64只，由贵州医科大学实验动物中心提供，许可证证号：SCXK(黔)2018-0001，雌雄各半，体重200～230 g，SPF级，单笼饲养，自由进食水，自然光线照射，相对湿度为50 %～60 %，饲养环境温度为(23±2) ℃，饲养于贵州医科大学实验动物中心实验动物中心。

1.3 动物分组与处理

将64只SD大鼠利用随机数字表法分为正常组、模型组、右归丸组、抑制剂组，每组15只。正常组不做任何处理，模型组、右归丸组、抑制剂组采用经典的Hulth法[7]建立膝骨性关节炎模型。术后6周制作右膝关节软骨病理切片证实造模成功。造模6周后，右归丸组灌服20 g/kg的右归丸(右归丸常规水煎制成2 g/mL的药液，灌服体积为10 mL/kg)[8]；抑制剂组腹腔注射1.2 mg/kg的SB431542[9]，同时灌服20 g/kg的右归丸；模型组灌服等剂量的生理盐水；3组每天给药1次，连续给药8周。

1.4 软骨组织病理形态观察

末次给药24 h后麻醉大鼠，取右膝关节软骨组织，其中一部分置于-80 ℃环境中保存，另一部分置于体积分数10 %甲醛中固定。固定24 h后取出关节软骨组织，脱钙处理后依次进行水合、透明、石蜡包埋处理，切片，切片厚度约5 μm，常规HE染色。同时番红O染色后进行Mankin 评分，评分低说明关节软骨损伤程度低。

1.5 ELISA法检测软骨组织中炎症因子水平

取出-80 ℃保存的软骨组织，在1 mg软骨组织中添加9 mg/L的生理盐水，置于匀浆器内制备匀浆液，5 000g离心10 min后收集上清液，利用ELISA检测试剂盒检测肿瘤坏死因子α与白细胞介素1β水平。

1.6 免疫组化染色

将切片置于枸橼酸缓冲液盒中进行微波修复2 min，加入3 %过氧化氢溶液室温孵育半小时，加入5 %山羊血清封闭抗原半小时，采用免疫组化染色观察软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白与基质金属蛋白酶13(MMP-13)阳性表达。

1.7 RT-PCR检测

采用RT-PCR法检测软骨组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达。将50 mg冷冻的软骨组织置于液氮中研磨成粉末，制成匀浆液；加入氯仿后混匀，4 ℃ 12 000g离心10 min；按照 RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit 试剂盒说明书操作提取总RNA。取各组样品总RNA 1 μL，利用核酸蛋白分析仪检测总RNA水平。PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser说明书操作进行反转录反应。将合成的cDNA进行RT-PCR反应，引物序列见表1。

表1 RT-PCR反应引物序列Table 1 Primer sequence of RT-PCR

1.8 Western blot检测

取软骨组织，将50 mg软骨组织放入研磨皿中裂解，将匀浆组织液12 000g离心3 min，取上清，95 ℃煮沸10 min变性，-20 ℃保存。采用BCA法检测蛋白浓度。取20 μL蛋白样品，加入5 μL的6×蛋白上样缓冲液混匀，加热5 min后冷却；按预定的顺序上样、恒压电泳，将目的蛋白转移至PVDF膜上，脱脂牛奶封闭1 h，加入稀释的一抗(兔抗鼠TGF-β1、未磷酸化Smad2、未磷酸化Smad3、p-Smad2、p-Smad3，稀释度分别为1∶1 000、1∶10 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶5 000)4 ℃孵育过夜；加入二抗羊抗兔IgG(稀释度分别为1∶2 000)室温孵育1 h，以β-actin为内参；ECL显影、曝光。

1.9 统计学处理

利用SPSS 22.0 软件对所有实验数据进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较差异采用t或t’检验。实验结果以均数±标准差表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模动物一般情况

实验期间造模动物无死亡。造模后，大鼠饮食、精神状态及活动情况较差，膝关节肿胀。

2.2 软骨组织病理形态观察

HE染色显示，正常组软骨组织表层细胞较小呈梭形，排列密集，中间层可见呈圆形或椭圆形的细胞，排列不规律，潮线清晰完整；模型组软骨表面不规则，大部分软骨表层细胞消失，软骨细胞数量显著减少，潮线紊乱甚至消失。抑制剂组与右归丸组软骨细胞形态与数量较模型组均有不同程度的改善，其中右归丸组软骨细胞大致趋于正常，潮线较完整。各组具体HE染色结果见图1。

注：a、b 正常组；c、d 模型组；e、f 抑制剂组；g、h 右归丸组。图1 软骨组织形态学观察(200×，n=15)Fig.1 Histological Observation of cartilage(200×，n=15)

番红-O染色显示，正常组潮线清晰完整；模型组潮线破坏较严重，不完整；抑制剂组潮线欠完整；右归丸组潮线较清晰且较完整。各组番红-O染色结果见图1。Mankin 评分评估结果显示，模型组评分明显高于正常组(P<0.05)，抑制剂组、右归丸组低于模型组(P<0.05)，右归丸组低于抑制剂组(P<0.05)，见表2。

2.3 软骨组织中炎症因子浓度

与正常组比较，模型组软骨组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平显著升高(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，抑制剂组、右归丸组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平显著降低(P<0.05)；与抑制剂组比较，右归丸组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平显著降低(P<0.05)，具体结果见表2。

表2 软骨组织Mankin 评分与炎症因子浓度(n=15)

2.4 免疫组化染色

正常组软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白阳性染色广泛分布、着色深，MMP-13阳性染色较少、着色浅；模型组软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白阳性染色显著减少、着色浅，MMP-13阳性染色广泛分布、着色深；抑制剂组、右归丸组Ⅱ型胶原蛋白阳性染色较模型组广泛、着色深，MMP-13阳性染色明显减少、着色变浅，见图2与图3。

图2 软骨组织内Ⅱ型胶原蛋白阳性表达(免疫组化，400×，n=15)Fig.2 Positive expression of type II collagen in cartilage (immunohistochemistry, 400×，n=15)

图3 软骨组织内MMP-13阳性表达(免疫组化，400×，n=15)Fig.3 MMP-13 positive expression in cartilage tissue (immunohistochemistry, 400×，n=15)

模型组Ⅱ型胶原蛋白累积光密度值低于正常组，而MMP-13累积光密度值高于正常组(P<0.05)；抑制剂组Ⅱ型胶原蛋白累积光密度值高于模型组，MMP-13累积光密度值低于模型组(P<0.05)；右归丸组Ⅱ型胶原蛋白累积光密度值高于抑制剂组，MMP-13累积光密度值低于抑制剂组(P<0.05)，具体数据见表3。

表3 软骨组织Ⅱ型胶原蛋白与MMP-13累积光密度值(n=15)

2.5 RT-PCR检测

模型组TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达较正常组显著降低(P<0.05)，抑制剂组TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 mRNA表达高于模型组(P<0.05)，右归丸组TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达高于抑制剂组(P<0.05)，具体数据见表4。

表4 软骨组织内TGF-β1、Smad2、Smad3表达(n=15)Table 4 The expression of TGF - β 1, Smad2 and p-Smad3 in cartilage tissue(n=15)

2.6 Western blot检测

Western blot检测结果显示，4组间未磷酸化Smad2、Smad3蛋白表达差异无统计学意义；模型组TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 蛋白表达较正常组显著降低(P<0.05)，抑制剂组TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 蛋白表达高于模型组(P<0.05)，右归丸组TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达高于抑制剂组(P<0.05)，具体数据见表4。4组未磷酸化Smad2、未磷酸化Smad3、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白条带见图4。

图4 软骨组织内TGF-β1/Smads信号通路蛋白表达条带(n=15)Fig.4 The Expression of TGF - β1 / Smads signaling pathway protein in cartilage(n=15)

3 讨论

本研究采用经典的Hulth法建立膝骨性关节炎模型，该方法主要通过手术破坏关节力学稳定性，进而导致骨性关节炎，发病机制与临床类似。本实验结果显示，造模后大鼠的软骨退变评分明显升高，病理组织形态学显示软骨表面不规则，结构紊乱，软骨细胞数量明显减少，潮线消失，Mankin 评分明显升高，与以往研究中骨性关节炎动物模型病理改变相似[10-11]，证实本实验造模成功。

《内经》中记载“肾主骨、肝主筋”, 依据这一中医理论, 认为骨性关节炎的主要病机特点是“肝肾亏虚为本，气滞、血瘀、痰湿凝聚为标”，中医宜采用“补肝肾、强筋骨、活血、祛瘀、止痛” 等中药治疗骨性关节炎。右归丸作为一种补肾方药含有多种有效成分，多药共同作用可温肾阳而兼顾阴阳，滋补肝脾肾，用于多种疾病的治疗。该方中附子、肉桂、鹿角胶培补肾中元阳里祛寒，为君药；熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药滋阴益肾，养肝补脾，填精补髓，取“阴中求阳” 之义，为臣药；再用菟丝子、杜仲补肝肾，强腰膝，配以当归养血和血，共补肝肾精血，为佐药。诸药合用，以温肾阳为主而阴阳兼顾，肝脾肾并补，妙在阴中求阳，使元阳得以归原。研究证实，补肾中药可减缓大鼠膝关节骨性关节炎的退变，起到保护膝关节的作用[12-13]。本研究结果表明，相较于模型组，右归丸组关节软骨退变Mankin 评分显著降低，软骨组织病理形态明显改善，证实右归丸可抑制软骨退变，减轻软骨损伤，具有治疗作用。

多型胶原、关节液与细胞外基质共同组成了关节软骨细胞微环境，其中Ⅱ型胶原蛋白是其中含量最高的胶原之一，生理状态下的软骨细胞主要分泌Ⅱ型胶原蛋白，但当软骨受损会影响细胞微环境，导致Ⅱ型胶原蛋白含量增加，进而破坏软骨结构[14]。另外，促炎症因子活化后加重炎症反应，通过降低软骨组织内的Ⅱ型胶原蛋白含量而诱导基质中的基质金属蛋白酶13释放，进一步降解Ⅱ型胶原蛋白。本研究结果显示，右归丸可减轻软骨组织内的炎症反应，平衡细胞外基质胶原表达，保护关节软骨组织。

TGF-β1在关节软骨发育中具有重要的作用。正常情况下，内环境中的TGF-β1通过与细胞表面的特异性受体结合来引发下游Smad家族的活化，引发一系列的信号传递，或者是与一些转录因子形成复合体，活化或抑制特定基因的表达。TGF-β1信号通路可以调控正常细胞的周期，调节其生长、增殖与分化等，并促进衰老细胞凋亡，维持机体正常状态。TGF-β1可促进软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白与蛋白聚糖的合成与分泌，提示TGF-β1在关节软骨发育中发挥着重要作用[15]，对骨性关节炎的关节软骨发挥保护作用。此外，也有一些研究者认为TGF-β1可诱发骨性关节炎[16]。所以，对于TGF-β1在骨性关节炎中的作用及其相关的信号通路仍有待更深入的探讨与研究。本研究结果显示，右归丸可能通过激活TGF-β1/Smads信号通路来发挥关节软骨保护作用的。为了进一步验证实验推测，本实验采用TGF-β1/Smads信号通路抑制剂对右归丸干预骨性关节炎模型大鼠进行处理，结果显示：软骨形态损伤加重，软骨组织病理评分升高，软骨组中的炎症因子肿瘤坏死因子α与白细胞介素1β水平升高，基质金属蛋白酶13阳性表达增加，Ⅱ型胶原蛋白阳性表达减少，提示右归丸可能通过激活TGF-β1/Smads信号通路延缓骨性关节炎关节软骨退变，减轻软骨炎症反应，维持软骨细胞外基质平衡，进而发挥软骨保护作用。遗憾的是本研究未设置骨性关节炎模型大鼠单独TGF-β1/Smads信号通路抑制剂干预组，因此对于TGF-β1/Smads信号通路在骨性关节炎中作用机制仍需进一步明确。

综上，右归丸可减轻软骨组织内的炎症反应，平衡细胞外基质胶原表达，保护关节软骨组织，其作用机制可能与TGF-β1/Smads信号通路有关。