分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物分析及其与番茄根结线虫病发生的关系

吴凤芝，田罡铭，白晶芝，王叶群，薛志佳

（东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨150030）

根结线虫（Meloidogynespp.）是一种威胁作物生长的病原物，在世界范围内危害巨大[1]。在设施栽培条件下，根结线虫易侵染番茄根系并繁殖，对番茄根部造成大面积破坏性损伤，导致番茄产量下降，情况较重者可减产50%以上，甚至绝产[2]。在根结线虫影响下，番茄抗逆抗病性变差，易出现枯萎病、根腐病等其他病害，形成复合病害，是影响番茄生产一大难题[3]。

传统上防治根结线虫主要采用化学农药，但化学农药增加生产成本，消费群体也普遍不认可[4]。随着人们对食品安全与生态环境的日益重视和化学农药的不可持续性，大多数杀线虫剂已被限制使用，甚至退市[5]。与化学农药相比，生态栽培技术防治通常更有效，环境友好[6]。其主要方式为主栽作物和抗线虫或非线虫寄主作物间、混、套作。杨帆等研究表明，伴生分蘖洋葱（Allium ce⁃paL.var.aggregatumG.Don）、普通白菜（Brassica campestrisssp.chinensis（L.）Makino）、薄荷（Mentha haplocalyxBriq.）、茴香（Foeniculum vulgareMill.）等作物可在不影响主栽作物番茄正常生长前提下使番茄根结数量和根结指数显著下降[7]。

利用农艺措施防治根结线虫病害的优势逐年显现，借助拮抗/杀线虫植物避免或阻挡根结线虫侵染与繁殖的过程复杂，且研究报道较少。研究表明，植物分泌的类黄酮和总酚可影响根结线虫病害，类黄酮物质具有驱赶线虫、减缓线虫移动速度、扭曲线虫雌雄比例，甚至杀死线虫等作用[8]。

刘佳遥等研究表明，分蘖洋葱鳞茎内含有丰富的黄酮类化合物[9]，且不同分蘖洋葱品种伴生减轻番茄根结线虫病效果不同[10]，因此推测分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物在抑制番茄根结线虫病中发挥作用。为明确分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物与番茄根结线虫病关系，本研究以44份分蘖洋葱种质资源为试材，分析其鳞茎黄酮类化合物含量与其伴生番茄减轻根结线虫病害间关系，以期为揭示分蘖洋葱伴生番茄减轻根结线虫病机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试根结线虫由东北农业大学设施蔬菜生理生态课题组保存，经鉴定为南方根结线虫。

供试分蘖洋葱由东北农业大学设施蔬菜生理生态课题组保存，具体名称见表1。

表1 分蘖洋葱品种Table 1 Potato onion varieties

1.2 试验方法

1.2.1 黄酮类化合物提取

分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物提取按照以下步骤：

①将44份分蘖洋葱鳞茎冻干处理48 h，直至质量守恒。②将冻干处理后分蘖洋葱鳞茎磨成粉末状并过筛储藏备用。③利用超声辅助法提取分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物作为待测样品[11]。④利用甲醇溶液配制1 mg·mL-1黄酮类化合物标准品母液并梯度稀释，见表2。

表2 黄酮类化合物标准品稀释浓度Table 2 Dilution concentration of flavonoids standard

完成提取后根据前期试验[10]，将两种抗线虫效果较好分蘖洋葱品种（M14和M37）和两种抗线虫效果较差分蘖洋葱品种（M29和M46）鳞茎提取的黄酮类化合物留作后续试验处理根结线虫试材。

1.2.2 根结线虫死亡率测定

根结线虫二龄幼虫悬浮液采用浸泡法获得[12]。打散混匀后吸取200 μL加入24孔培养板中，每孔分别加入3 mL不同分蘖洋葱（M14、M29、M37和M46）鳞茎黄酮类化合物，对照组采用灭菌水代替黄酮类化合物，每处理设5次重复。处理6和12 h时镜检计数，采用氢氧化钠刺激法观察线虫存活情况。

1.2.3 根结线虫虫卵孵化测定

运用浸泡法配制根结线虫虫卵悬浮液[12]，打散混匀后吸取200 μL加入24孔培养板中，每孔分别加入3 mL不同分蘖洋葱（M14、M29、M37和M46）鳞茎黄酮类化合物，对照组采用灭菌水代替黄酮类化合物，每处理设5次重复。分别在3、6和9 d镜检计数。

虫卵孵化抑制率(%)=

1.2.4 根结线虫趋化性测定

采用平板法调查根结线虫趋化性[13]。如图1所示，于Φ 9 cm培养皿中取3点，将100条J2s放入中间点，再将1 mL分蘖洋葱鳞茎黄酮类化合物分别打入另外两个点。处理1 h观察、计数。图1中字母区域代表排斥，数字区域代表吸引，计算趋化性Cf值（1.0≤Cf≤1.5：无趋化性；Cf<1.0：排斥；Cf>1.5：吸引）。

图1 平板试验Fig.1 Schematic diagram of plate test

1.2.5 黄酮类化合物的分析与含量测定

分别采用内标法与外标法定性和定量测定类黄酮样品[14-15]。色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（Analytical 4.6×250 mm，5-Micron）。待筛选流动相及流速见表3，以各条件分别等度梯度洗脱，筛选比对，选出分离度较佳，峰形较好的条件。黄酮类化合物检测波长分别为257 nm（芦丁）和360 nm（山奈酚、槲皮素、杨梅黄酮），流速为0.8 mL·min-1，柱温为22℃。

按照浓度梯度准确吸取黄酮类化合物标准品工作液，每针进样10 μL，每处理重复3次，得到峰面积，分别以浓度和峰面积A为横轴与纵轴，制作标准曲线，计算回归方程。

分别按照上述方法，于待测黄酮类化合物样品制备后0、2、4、8、16、24 h取同一份待测样，检验待测样24 h内稳定性。

分别准确吸取黄酮类化合物标准品溶液，按上述方法重复测定6次，检验其重复性。

在一份已知含量待测样中加入黄酮类化合物标准品，采用上述方法测定含量，计算加标回收率。

得到类黄酮含量数据后，将其与黄酮类化合物处理下根结线虫死亡率、虫卵孵化抑制率、趋化性Cf值及前期试验获得的番茄根结线虫病情指标[10]作相关性分析。

2 结果与分析

2.1 分蘖洋葱鳞茎中黄酮类物质种类及含量分析

2.1.1 黄酮类物质提取条件确定

黄酮类化合物HPLC色谱图见图2。由表4可知，通过回归方程计算结果可发现，分蘖洋葱鳞茎中山奈酚、槲皮素、杨梅黄酮、芦丁4种黄酮类化合物线性关系良好。通过样品峰面积RSD可发现待测样在24 h内保持稳定。通过标准品峰面积RSD可发现试验重复性良好。由表5可知，本方法回收率良好。

表4 黄酮类化合物线性关系和峰面积Table 4 Linear relationship and peak area of flavonoids

表5 黄酮类化合物加标回收率Table 5 Recovery of flavonoids by standard addition

2.1.2 分蘖洋葱鳞茎中芦丁含量分析

由图3可知，各品种分蘖洋葱鳞茎中芦丁含量差异较大，为11.18~126.28 mg·100 g-1DW。其中M39和M51鳞茎中芦丁含量显著高于其他品种（P<0.05），分别为68.37和126.28 mg·100 g-1DW。M02、M13、M21、M23、M32与M33鳞茎中芦丁含量显著低于其他品种（P<0.05），分别为16.29、14.85、16.19、16.46 mg·100 g-1DW。

图3 44份分蘖洋葱鳞茎芦丁含量Fig.3 Rutin contents in 44 potato onion bulbs

2.1.3 分蘖洋葱鳞茎中杨梅黄酮含量分析

由图4可知，各品种分蘖洋葱鳞茎中杨梅黄酮含量差异较大，为60.17~189.83 mg·100 g-1DW。其中M11和M14鳞茎中杨梅黄酮含量显著高于其他品种（P<0.05），分别为181.35和189.83 mg·100 g-1DW。M40鳞茎中杨梅黄酮含量显著低于其他品种（P<0.05），为60.17 mg·100 g-1DW。

图4 44份分蘖洋葱鳞茎杨梅黄酮含量Fig.4 Myricetin contents in 44 potato onion bulbs

2.1.4 不同分蘖洋葱鳞茎中槲皮素含量分析

由图5可知，各品种分蘖洋葱鳞茎中槲皮素含量差异较大，为464.22~1 968.14 mg·100 g-1DW。其中M11和M51鳞茎中槲皮素含量显著高于其他品种（P<0.05），分别为1 968.14和1 902.15 mg·100 g-1DW。M38和M40鳞茎中槲皮素含量显著低于其他品种（P<0.05），分别为512.21和464.22 mg·100 g-1DW。

图5 44份分蘖洋葱鳞茎槲皮素含量Fig.5 Quercetin contents in 44 potato onion bulbs

2.1.5 不同分蘖洋葱鳞茎中山奈酚含量分析

由图6可知，各品种分蘖洋葱鳞茎中山奈酚含量差异较大，为5.28~23.13 mg·100 g-1DW。其中M05、M12、M15与M19鳞茎中山奈酚含量显著高于其他品种（P<0.05），分别为20.79、23.12、21.76、21.36 mg·100 g-1DW。M04、M07、M11与M31鳞茎中山奈酚含量显著低于其他品种（P<0.05），分别为5.75、5.50、5.62、5.28 mg·100 g-1DW。

图6 44份分蘖洋葱鳞茎山奈酚含量Fig.6 Kaempferol contents in 44 potato onion bulbs

2.1.6 不同分蘖洋葱鳞茎中总黄酮含量分析

由图7可知，各品种分蘖洋葱鳞茎中总黄酮含量差异较大，为593.22~2 204.88 mg·100 g-1DW，M11和M51鳞茎中总黄酮含量显著高于其他品种（P<0.05），分别为2 186.59和2 204.88 mg·100 g-1DW。M38、M40与M46鳞茎中总黄酮含量显著低于其他品种（P<0.05），分别为617.75、593.22、661.14 mg·100 g-1DW。

图7 44份分蘖洋葱鳞茎总黄酮含量Fig.7 Total flavonoids contents in 44 potato onion bulbs

2.2 分蘖洋葱鳞茎黄酮类化合物对根结线虫死亡率的影响

由表6可知，从4种分蘖洋葱鳞茎中提取的黄酮类化合物在处理6 h和12 h时均未对根结线虫死亡率产生显著影响。

表6 根结线虫死亡率Table 6 Mortality of root knot nematode

2.3 分蘖洋葱鳞茎黄酮类化合物对根结线虫虫卵孵化的影响

由表7可知，在处理12 d时，M29鳞茎中黄酮类化合物处理下根结线虫虫卵孵化抑制率显著高于对照（P<0.05），说明分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物可抑制根结线虫虫卵孵化，但需处理一定时间。

表7 根结线虫虫卵孵化抑制率Table 7 Hatching inhibition rate of root knot nematode eggs

2.4 分蘖洋葱鳞茎黄酮类化合物对根结线虫趋化性的影响

由表8可知，在4种分蘖洋葱鳞茎黄酮类化合物处理下，根结线虫趋化性Cf值均显著低于对照（P<0.05），说明分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物可影响根结线虫迁移。

表8 根结线虫趋化性Cf值Table 8 Chemotaxis Cf value of root knot nematode

2.5 分蘖洋葱鳞茎黄酮类化合物与根结线虫死亡率、虫卵孵化率及根结线虫趋化性Cf值相关性分析

由表9可知，分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物含量与根结线虫死亡率不相关。分蘖洋葱鳞茎中杨

表9 分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物与根结线虫死亡率、虫卵孵化率及根结线虫趋化性Cf值相关性分析Table 9 Correlation analysis between flavonoids in potato onion bulbs and mortality,hatchability and chemotaxis Cf value of root knot nematode

2.6 分蘖洋葱鳞茎黄酮类化合物与根结线虫病相关性分析

由表10可知，芦丁和山奈酚含量与根结线虫病不相关；杨梅黄酮含量与根结线虫虫口防效呈梅黄酮、槲皮素、山奈酚、总黄酮含量与根结线虫虫卵孵化抑制率均呈显著正相关（P<0.05）。分蘖洋葱鳞茎中芦丁、杨梅黄酮、槲皮素、山奈酚、总黄酮含量与根结线虫趋化性Cf值均呈极显著负相关（P<0.01）。显著正相关（P<0.05），与根结线虫病情指数和番茄根结指数呈极显著负相关（P<0.01）；槲皮素和总黄酮含量与根结线虫发病率、病情指数和番茄根结指数呈显著负相关（P<0.05）。

表10 分蘖洋葱鳞茎黄酮类化合物与根结线虫病害相关性分析Table 10 Correlation analysis between flavonoids in potato onion bulbs and root knot nematode disease

3 讨论与结论

黄酮类化合物作为一种天然聚合物，对细菌、真菌、病毒和寄生虫有明显影响[16]。关于植物材料中提取黄酮类化合物方法较多，利用冻干法处理植物材料可最大限度保留其中黄酮类物质，超声辅助法可保证提取效率[11]。因此，本试验采用超声辅助法提取经冻干处理的分蘖洋葱鳞茎，提取率为2.608%，高效液相色谱法是植物材料黄酮类化合物最常用检测方法，不同色谱条件效果不同[14]。本试验通过多种条件比对筛选出分别以甲醇和0.4%磷酸溶液为流动相A和B，流速分别为0.44和0.36 mL·min-1条件下峰型与分离情况俱佳。本研究发现槲皮素是分蘖洋葱鳞茎中含量最多的黄酮类化合物。本研究44份分蘖洋葱品种中，M11和M51鳞茎中黄酮类化合物含量最高，两个品种鳞茎中槲皮素和总黄酮含量显著高于其他品种。此外，相较于其他品种，在M11和M51鳞茎中分别含有大量杨梅黄酮和芦丁。

本试验中，分蘖洋葱鳞茎内提取的黄酮类化合物未显著影响根结线虫存活，但显著影响线虫趋化性，处理12 d时M29鳞茎中类黄酮类化合物显著提高根结线虫虫卵孵化抑制率，与前期研究结果相同。前期预试验结果显示，在高浓度标准品芦丁处理下，显著降低根结线虫存活率和虫卵孵化率，与Bano等研究结果一致[17]。Bano等研究表明，从植物材料中提取的黄酮类化合物受限于不同种类与浓度，对根结线虫致死率低，可显著影响根结线虫虫卵孵化和迁移性[17]。也有研究证明，山奈酚、杨梅素、槲皮素和芦丁对线虫幼体具有致死作用[18]。因此，本研究得出分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物可影响根结线虫趋化性及根结线虫虫卵孵化，但对根结线虫无致死效果。原因可能是分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物浓度未达到杀线水平；根结线虫成体后对分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物抵抗能力增强；分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物需与其他活性物质产生复合作用才可有效控制根结线虫病害。对分蘖洋葱鳞茎中黄酮类化合物浓度与抑杀根结线虫防效关系，有待进一步研究。

植物材料中提取的不同种类与浓度黄酮类化合物对根结线虫作用效果不同[19]。本试验研究结果显示，分蘖洋葱鳞茎中杨梅黄酮、槲皮素、山奈酚、总黄酮含量与根结线虫虫卵孵化抑制率均呈显著正相关；分蘖洋葱鳞茎中芦丁、杨梅黄酮、槲皮素、山奈酚、总黄酮含量与根结线虫趋化性Cf值均呈极显著负相关，与Wuyts等研究结果一致[8]。Wuyts等研究表明，山奈酚对根结线虫虫卵孵化有不利影响，山奈酚、槲皮素和杨梅黄酮对根结线虫既有排斥作用，又有杀线虫作用[8]。分蘖洋葱鳞茎中杨梅黄酮含量与根结线虫虫口防效呈显著正相关，与根结线虫病情指数和番茄根结指数呈极显著负相关；槲皮素和总黄酮含量与根结线虫病情指数、发病率和番茄根结指数具有显著负相关性，与Bar等研究结果一致[20]。说明分蘖洋葱鳞茎中杨梅黄酮和槲皮素可能是分蘖洋葱伴生减轻番茄根结线虫病的作用因子。