硒对铅中毒诱导蛋鸡肾脏炎症损伤缓解作用研究

2021-11-11刘桐序

东北农业大学学报 2021年9期

赵骞，刘桐序，李琦，秦雪，黄贺

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030）

铅（Pb）是一种有毒物质，不仅导致饲料、食品、水土污染，也损害人类神经系统、心血管系统以及生殖系统[1-2]。铅过量可诱发人和动物炎症并损害肾脏[3]。炎症产生与白细胞介素-6（IL-6）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、核因子-κB（NF-κB）和环氧化酶-2（COX-2）有关[4]。NF-κB可介导炎症反应且调控TNF-α和COX-2等表达[5]；NF-κB、TNF-α和COX-2均参与铅诱导的肝脏炎症[6]。氧化应激与鸡法氏囊和肠道损伤有关[7]，铅可通过改变谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）诱导氧化应激。鸡血清中肌酐（CREA）和尿酸（UA）含量是检测机体肾功能的指标，当肾脏发生损伤时，肾功能减退，引起CREA和UA含量升高[8]，可通过检测两者浓度判断铅对肾功能的损伤。

硒（Se）是一种具有抗氧化和抗炎特性的微量元素[9]，可减轻铅处理后鸡只氧化应激反应[10]、细胞因子[7]和炎症损伤[11]。杨凯研究发现硒改善铅诱导鸡免疫器官中T-AOC、GPx、GST、SOD和CAT活力及GSH、MDA和H2O2含量[12]；王克鑫研究表明硒缓解铅对鸡肾脏毒性[13]；Xu等研究表明长期暴露于硒和铅会影响鸡肝中离子分布，硒对铅的缓解作用可能与鸡肝中离子谱变化有关[14]。

目前关于铅中毒对机体损伤研究较多，且大多集中于人类与啮齿动物。肾脏是铅中毒重要靶器官之一，但硒对铅诱发肾脏炎症的缓解作用尚未完全了解，需进一步研究。因此，文章以鸡为研究对象，设计铅硒互作模型，通过检测铅硒浓度、肾脏功能、氧化应激指标和炎症相关因子，继续探讨炎症机制及硒对铅引起的鸡肾脏炎症缓解作用，为铅对肾脏的毒性研究和硒对铅引起的肾脏炎症缓解提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与管理

于哈尔滨先锋孵化场购买80只1日龄海兰白蛋鸡，饲喂一周标准日粮和饮水后，选择体重相近72只健康小鸡随机平均分配到对照组、铅组、硒组和铅硒组中，各组日粮和饮水分别为：对照组采用标准日粮，标准饮水；铅组采用标准日粮，加铅饮水（350 mg·L-1铅）；硒组采用加硒日粮（1 mg·kg-1硒），标准饮水；铅硒组采用加硒日粮（1 mg·kg-1硒），加铅饮水（350 mg·L-1铅）。日粮和饮水中通过添加Na2SeO3和（CH3OO）2Pb达到设定浓度。蛋鸡在正式试验过程中单笼饲养，自由采食和饮水。分别在试验第4、8和12周后，心脏取血后置于EP管中用于检测肾功能指标。然后对蛋鸡进行安乐死，置于冰盘上解剖，采集肾脏组织，用于试剂盒检测和mRNA表达、蛋白质表达检测。

1.2 肾脏中硒和铅浓度检测

每个肾脏样品（约1 g）和空白对照分别于80℃下消化4 h后用纯水将溶液定容至10 mL，溶液分别在100℃、150℃和180℃加热3、10和45 min。用纯水将获得的样品体积定容至10 mL，电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS；Thermo iCAPQ，USA）测定样品中铅和硒浓度。

1.3 肾功能指标检测

将采集血液样品静置30 min后以4 000 r·min-1离心10 min取上清液，使用自动化诊断分析仪按照试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）说明检测鸡血清中肌酐（CREA）（Kit number：C011-2）和尿酸（UA）（Kit number：C012-1）含量。

1.4 氧化应激指标检测

将一部分肾脏组织样本匀浆，用生理盐水稀释10倍，2 500 r·min-1离心10 min，收集上清液，按照试剂盒说明（购自南京建成生物工程研究所）测定MDA、GSH、GPx和SOD含量。

1.5 mRNA表达检测

每个肾脏样本取约0.1 g，加入1 mL TRIzol试剂（TaKaRa，Japan），用冷冻研磨仪反复研磨至样本粉碎，提取肾脏组织总RNA。用分光光度计（保健生物科学公司，瑞典）测定RNA的OD260/OD280。使用试剂盒（PrimeScriPt™RT，日本），在60 μL反应体系中将提取总mRNA合成cDNA。β-actin作为内参基因，引物由上海Invitrogen公司合成，序列见表1。用试剂盒（罗氏公司，瑞士）在10 μL反应体系中作实时荧光定量PCR反应，用2-ΔΔCT方法计算mRNA相对表达量。

表1 实时定量PCR引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.6 蛋白质表达检测

第12周用Western、IP细胞裂解缓冲液（Beyo⁃time，上海）和苯甲基磺酰氟（Beyotime，上海）提取鸡肾脏总蛋白。蛋白浓度用BCA蛋白检测试剂盒（Thermo Scientific，美国）测定。总蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，在含20%甲醇的三甘氨酸缓冲液中转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂牛奶在37℃用一级抗体孵育硝化纤维素膜2 h（cas⁃pase-1、TNF-α、NF-κB、NLRP3和COX-2），4℃过夜保存，在磷酸缓冲盐水中用吐温20洗涤3次（每次15 min），用过氧化物酶结合物和辣根过氧化物酶结合物二级抗体孵育细胞膜。添加新制的BeyoECL Plus（Beyotime，Shanghai，上海），最后使用化学发光仪器（Amersham Imager 600 RGB，General Electric Company，美国）对膜进行成像。

1.7 数据统计分析

结果以平均数±标准差（n=6）表示，用R 3.6.2作统计分析。对硒和铅浓度、肌酐和尿酸含量及caspase-1、TNF-α、NF-κB、NLRP3和COX-2蛋白表达量作正态性和方差齐性检验，通过后用单因素方差分析，对存在显著差异因素用Bonfferoni作多重比较分析。对氧化应激指标、细胞因子和炎症相关基因mRNA表达量作正态性和方差齐性检验，通过后用双因素方差分析，对存在显著差异的因素用Bonfferoni法作多重比较；若未通过正态性和方差齐性检验，用Kruskal-Wallis秩和检验分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 血清中肌酐和尿酸含量及肾脏中硒和铅浓度

为评估铅和硒对肾功能的影响，在第12周时测定血清中肌酐和尿酸含量及肾脏中硒和铅浓度，结果见图1。

由图1A和1B可知，肌酐和尿酸含量在对照组和硒组中差异不显著（P>0.05）；铅组和铅硒组中肌酐含量显著高于对照组和硒组（P<0.05），铅组显著高于铅硒组（P<0.05）。由图1C可知，硒浓度由高到低为硒组、对照组、铅硒组和铅组，组间差异显著（P<0.05）。由图1D可知，铅浓度由高到低为铅组、铅硒组、对照组和硒组，组间差异显著（P<0.05）。

图1 血清中肌酐和尿酸含量及肾脏中硒和铅浓度Fig.1 Se and Pb concentrations in chicken kidneys and CREA and UA contents in chicken serum

2.2 MDA、GSH含量及SOD、GPx活性

为评估铅和硒对氧化应激的影响，在第4、8和12周时测定鸡肾脏中MDA和GSH含量及SOD和GPx活性（见图2）。除对照组和硒组之间MDA和GSH含量及SOD活性外，各组MDA（见图2A）和GSH（见图2B）含量及SOD（见图2C）和GPx（见图2D）活性在3个时间点上均差异显著（P<0.05）。与对照组和硒组相比，铅组和铅硒组MDA含量显著提高（P<0.05），其他3个指标显著降低（P<0.05）。与铅硒组相比，铅组MDA含量显著升高（P<0.05），其他3个因子显著降低（P<0.05）；对照组GPx活性显著低于硒组（P<0.05）。此外，MDA含量随铅处理时间增加呈显著上升趋势（P<0.05），其他指标均呈显著下降趋势（P<0.05）。

图2 氧化应激指标Fig.2 Oxidative stress indicators

2.3 细胞因子mRNA表达

本试验中，在3个时间点检测鸡肾脏中IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ中mRNA表达水平（见图3）。4种细胞因子中检测结果在对照组和硒组间均无显著差异（P>0.05）。与对照组相比，IL-1β（见图3A）、IL-6（见图3B）、IL-17（见图3C）mRNA表达水平显著升高（P<0.05）；第8和12周时铅硒组和铅组IFN-γ的mRNA表达水平显著低于对照组和硒组（P<0.05）。第4、8和12周，铅组中IL-1β、IL-6、IL-17的mRNA表达随铅处理时间增加显著升高（P<0.05），相反IFN-γ的mRNA表达显著降低（P<0.05）。可看出IL-1β、IL-6、IL-17的mRNA表达随铅处理时间增加呈显著升高趋势（P<0.05），IFN-γ mRNA表达水平呈显著下降趋势（P<0.05）。

图3 细胞因子mRNA表达Fig.3 mRNA expression of cytokines

2.4 炎症因子mRNA和蛋白质表达

为确定铅是否能引起炎症损伤和硒对铅毒性缓解作用，在第4、8和12周检测caspase-1（见图4A）、TNF-α（见图4B）、NF-κB（见图4C）、NLRP3（见图4D）、COX-2（见图4E）mRNA表达及上述因子在第12周蛋白质表达水平（见图4F）。上述指标在对照组与硒组间差异不显著（P>0.05）。与对照组和硒组相比，铅组和铅硒组中caspase-1、TNF-α、NF-κB、NLRP3和COX-2中mRNA和蛋白质相对表达量显著升高（P<0.05）。铅组上述因子mRNA和蛋白质表达量也显著高于铅硒组（P<0.05），且mRNA表达量均随铅处理时间增加呈显著升高趋势（P<0.05）。

图4 炎症因子mRNA和蛋白表达Fig.4 mRNA and protein expression of inflammatory factors

3 讨论

肾脏是铅积累主要器官，过量铅损害鸡肾脏功能并引起炎症。NLRP3激活有助于小鼠慢性促炎状态发展[15]，研究发现炎症参与铅引起的小鼠肾脏损伤[16]。本研究中铅处理后蛋鸡肾脏中发现高浓度铅，血清中肌酐和尿酸含量升高说明铅发挥毒性并诱导鸡肾脏发生炎症损伤。此外，发现补充铅增加蛋鸡肾脏组织铅浓度且降低硒浓度，进一步证明铅在肾脏有积累效应。

NLRP3炎症体是炎症性疾病的广泛特征之一。NLRP3炎症小体中caspase-1的激活可诱导IL-1β和IL-18成熟，促进炎症反应[17]。NLRP3、caspase-1和IL-1β在血红素引起的小鼠肾脏炎症中表达上调[18]；H2S暴露增加IL-1β的表达导致蛋鸡胸肺炎症损伤[19]。因此，研究NLRP3、caspase-1和IL-1β是否与铅处理蛋鸡肾脏炎症损伤有关。在铅处理蛋鸡肾脏中，NLRP3、caspase-1和IL-1β表达上调并发生炎症反应，表明NLRP3是通过触发caspase-1和IL-1β介导铅引起炎症损伤。此外第12周铅组NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平分别是对照组的10.45倍、13.05倍和4.90倍，因此推测NLRP3炎症小体、caspase-1和IL-1β可能是铅致蛋鸡肾脏炎症损伤的敏感因子。

NF-κB、TNF-α和COX-2在炎症反应中起重要作用。研究表明，过量铅增加NF-κB、TNF-α和COX-2中mRNA表达水平进而引起蛋鸡肠道炎症反应[20]。本研究中进一步研究发现，铅处理蛋鸡肾脏中NF-κB、TNF-α和COX-2 mRNA和蛋白质表达水平升高，IL-6、IL-17 mRNA表达水平升高、IFN-γmRNA表达水平下降并发生炎症反应，进一步证实铅对鸡肾脏造成炎症损伤。另外发现，在鸡肾脏中NLRP3、caspase-1、细胞因子（包括IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ）和炎症因子（包括NF-κB、COX-2和TNF-α）mRNA表达与染铅毒时间有关。Sun等研究也认为NF-κB、TNF-α和COX-2的mRNA在淋巴细胞[21]和睾丸[22]中表达均具有时间效应。

有害物质（如镉、硫化氢、氨）也可诱导氧化应激。GSH、SOD和GPx是抗氧化酶，能抵抗活性氧引起的副作用，相反MDA是氧化应激标志物，指示活性氧过度产生和细胞膜损伤。Chi等研究发现，铅暴露导致鸡肝脏氧化损伤，抑制GST和GPx等抗氧化酶活性同时增加MDA含量[23]；铅通过降低鸡睾丸中GSH、SOD和GPx导致氧化应激[24]。本文预测氧化应激与炎症发生有关，并通过测定GSH和MDA含量及SOD和GPx活性验证。本研究发现铅处理后MDA含量升高，GSH含量、SOD和GPx活性降低且出现氧化应激反应。从上述发现推断，铅引起的氧化应激激活NLRP3进一步刺激炎症反应引起鸡肾脏损伤，与上述研究结果一致。另外，上述氧化应激指标变化也与铅处理时间有关。

硒可减轻铅对鸡器官造成的损伤。研究发现铅浓度、CREA和UA含量升高及硒浓度下降，表明硒减轻铅引起肾脏炎症损伤。硒具有拮抗铅引起鸡肝脏炎症因子及热休克蛋白表达增加的作用[25]；Özkan-Yılmaz等研究发现，硒可改善铅诱导鲤鱼肝脏和脑组织氧化应激[26]；硒拮抗铅引起尼罗罗非鱼肾毒性，可改善铅中毒尼罗罗非鱼肾功能[27]，均与本文研究结果一致。但具体缓解作用机制尚不明确，可能是因硒与重金属铅形成硒-铅复合物，缓解铅毒性[28]。

考虑到硒抗氧化和抗炎特性，本文进一步研究硒是否缓解铅诱导鸡肾脏氧化应激和炎症。硒处理使鸡睾丸中GSH含量和SOD活性增加并缓解氧化应激[29]。硒通过降低脂多糖处理巨噬细胞中NF-κB、TNF-α和IL-6缓解炎症[30]。本试验中，硒缓解由铅引起的MDA、NLRP3炎性小体、cas⁃pase-1、NF-κB、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17增多及GSH、SOD、GPx、IFN-γ减少，与前人研究结果一致。从上述结果推断，硒缓解鸡肾脏中铅引起的氧化应激和炎症反应。