低钙日粮对蛋鸡龙骨微结构参数和骨骼元素浓度的影响

2021-11-11张润祥陈艳青杨凯淇于翰林王晓萱魏海东李纯李剑虹包军

东北农业大学学报 2021年9期

张润祥，陈艳青，杨凯淇，于翰林，王晓萱，魏海东，李纯，李剑虹，包军*

（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030；2.农业农村部鸡遗传育种重点实验室，哈尔滨150030；3.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）

钙是动物体必需营养成分，影响蛋壳形成和骨骼健康。蛋鸡对钙元素有较高代谢需求，缺钙导致骨质流失，易引发骨质疏松症。龙骨损伤是危害蛋鸡生产福利问题之一。研究钙营养水平与蛋鸡龙骨损伤关系及对龙骨结构参数的影响，将为降低龙骨损伤发生率提供钙营养思路。

钙主要以磷酸钙方式储存在骨骼中，并以碳酸钙形式储存于蛋壳中[1]。我国蛋鸡摄入100 g饲料钙推荐量为3.5%[2]。骨骼是一种受生理、营养和物理因素如机械应力和身体活动影响的动态生物组织，含有大量骨细胞，成骨细胞和破骨细胞不断重塑和修复维持骨骼健康[3]。由于产蛋行为特殊需求，蛋鸡具有独特骨代谢和生理过程[4]。在产蛋期开始时，蛋鸡停止正常的骨骼生长并发育成髓质骨[5]。随产蛋持续进行，骨强度降低和骨脆性增加，蛋鸡易发生骨折[6]。家禽龙骨是一种从胸骨延伸并轴向越过中线的结构骨，在禽类骨骼中具有特殊地位，在禽类飞行和呼吸过程中发挥重要作用。龙骨损伤包括龙骨骨折和龙骨弯曲，龙骨骨折可能与蛋鸡对产蛋行为适应性与突然碰撞等行为学事件发生有关，也与笼舍设施资源、钙磷营养代谢水平及遗传品种相关，龙骨骨折主要发生产蛋开始至45周龄阶段[7-8]。龙骨损伤不仅改变蛋鸡行为表现，降低生产性能和鸡蛋质量，还影响蛋鸡情绪和生理状况，给家禽养殖业造成经济损失[7-9]。因此，龙骨损伤特别是龙骨骨折已成为商业蛋鸡的生产和福利问题。因此，本文聚焦钙营养，探讨低钙日粮对蛋鸡龙骨损伤发生率、龙骨微观结构和离子浓度的影响。

微计算机断层扫描技术（Micro-CT）已被广泛用于评估动物骨骼微结构[10]。评估骨微结构参数包括骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁分离度（Tb.Sp），骨小梁数量（Tb.N）和连接密度（Conn.D.）[11]。研究结果表明，蛋鸡龙骨骨折改变龙骨骨骼质量，导致骨体积分数、小梁数、各向异性度（DA）和连接密度减少及小梁分离增加[12]。骨质疏松还导致鸡股骨质量下降和小梁显微结构改变[13]。

饲粮低钙水平影响蛋鸡骨骼健康，为了解饲粮低钙水平与蛋鸡龙骨损伤之间关系及低钙日粮对蛋鸡龙骨骨骼微观参数和离子浓度的影响，本研究对产蛋初期蛋鸡持续饲喂低钙日粮17周，测定蛋鸡龙骨骨折发生率、骨矿物密度（BMD）、结构参数和元素浓度，揭示低钙日粮对蛋鸡龙骨参数的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料和饲养方案

本试验购买20周龄（wk）健康罗曼白蛋鸡180只（购自黑龙江先锋民胜种鸡场），随机分为对照组（Con）组和低钙饮食（LCa）组，每组6个笼子，每笼15只。将蛋鸡饲养于富集笼（长×宽×高为180 cm×70 cm×70 cm，含有方型木制栖架、草坪垫）和红色半封闭产蛋箱，每笼配置乳头饮水器。鸡舍为半封闭饲舍，蛋鸡自由进食和饮水。试验期间（20~37 wk），鸡舍温度和湿度分别控制在22~26℃和45%~65%。鸡舍机械通风并配合自然通风，采用自然光和人工光照结合方式，光照周期为16L∶8D。日粮营养水平中，对照组有效钙水平为3.37%，低钙组有效钙水平为1.5%。饲粮组成和营养水平如表1所示。

表1 蛋鸡饲粮组成及营养水平Table 1 Dietary composition and nutrient levels of laying hens

1.2 龙骨损伤评估

龙骨损伤判定依据Scholz等[14]和Richard等[15]介绍的活鸡触诊方法，为减小触诊误差，龙骨损伤触诊判定均由1人完成。触诊时，1只手从翅根处固定翅膀，抓起鸡暴露腹部，另1只手食指和拇指沿龙骨腹外侧边缘触摸，判断龙骨是否发生损伤。根据龙骨是否存在弯曲和骨折，将龙骨状态分为3类：正常龙骨（NK）、弯曲龙骨（DK）和骨折龙骨（FK）。正常龙骨从龙骨矢状面尖端到尾部呈180°直线或从龙骨尖端到尾部偏离矢状面范围<0.5 cm；弯曲龙骨是指偏离范围>0.5 cm，且龙骨表面光滑，无任何明显位移或骨膜疤痕，也无凸起或肿胀。骨折龙骨指龙骨表面有明显凸起，伤疤、肿胀、断裂、位移或胼胝形成。弯曲和骨折同时存在判定为龙骨骨折，因为骨折痛和伤害远超过弯曲。在第25、29、33和37周，评估所有蛋鸡龙骨损伤状况。根据每个时间点触诊结果计算龙骨损伤发生率，最后1次龙骨损伤以解剖后视诊为准。

1.3 样品采集

每个时间点评估蛋鸡龙骨状态，记录龙骨损伤发生率。最后1次触诊后剖杀鸡只，将龙骨切除，肌肉和其他与龙骨连接软组织完全移除，采集龙骨样品，储存于-80℃冰箱进一步分析。

1.4 显微计算机断层扫描分析

将对照组和低钙组蛋鸡龙骨样品（每组n=6）尾端分别切割1.3 cm，浸泡在4%多聚甲醛溶液中用于显微计算机断层扫描分析（Micro-CT，CT 50斯堪科医疗股份有限公司，瑞士苏黎世）。检测条件中体素尺寸16 m，源电位70 kV，电流200 A，积分时间300 ms，铝滤波器0.5 mm。每次扫描均使用Mimics 19.0重构。骨分析（ABA）软件确定骨微结构参数：骨矿物质密度（BMD）、骨表面积和组织体积比值（BV/TV）、骨骼表面（BS）、骨表面和骨组织比值（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁数目（Tb.N）、各向异性的程度（DA）和连接密度（Conn.D.）。

1.5 龙骨矿物质元素浓度测定

从对照组和低钙组蛋鸡龙骨样品中，选择距尾缘2 cm处切割1.0 g样品，于液氮中研磨成粉末状，微波消解仪消解，使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，Thermo iCAP Q，MA，USA）测定元素浓度。29种骨矿物质元素，包括锂（Li）、硼（B）、钠（Na）、镁（Mg）、铝（Al）、硅（Si）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、钛（Ti）、钒（V）、铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、钴（Co）、镍（Ni）、铜（Cu）、锌（Zn）、砷（As）、硒（Se）、锶（Sr）、钼（Mo）、镉（Cd）、锡（Sn）、锑（Sb）、钡（Ba）、汞（Hg）、铊（Tl）和铅（Pb）。将每个龙骨样品在含有5 mL 65%（W/W）HNO3和2 mL 30%H2O2（W/V）溶液中消解，然后用去离子水稀释至10 mL。随后在功率为1 800 W微波消解系统中再次消解样品：100℃3 min，150℃10 min和180℃45 min。待样本冷却至室温后，所有消解样品均用超纯水稀释至50 mL，充分混合后用ICP-MS分析。ICP-MS操作参数如下：频率27.12 MHz，反射功率1 550 W，载气流量1.05 L·min-1，等离子气体流量14.0 L·min-1，辅助气体流量0.8 L·min-1，S/C温度为2.7℃，采样深度为6.0 mm，雾化器泵40 r·min-1，氧化物离子（156/140）<2.0%，双电荷（70/140）<3.0%。所有矿物质元素含量均采用空白和标准品计算。

1.6 统计分析

通过统计分析软件SPSS 22（SPSS Inc.Chicago，IL，USA）分析所有数据。使用Kolmogorov-Smirnov法对骨微结构参数、矿物密度及元素浓度数据检验正态分布，均符合正态分布。使用非配对t检验比较从对照组和低钙组获得数据统计差异，当P<0.05时被认为具有统计学显著性差异。

2 结果与分析

2.1 龙骨损伤

图1 显示蛋鸡在4个时间点龙骨损伤评估结果。在25、29、33和37周龄时，低钙组蛋鸡龙骨损伤（包括龙骨弯曲和龙骨骨折）发生率高于对照组。自25~37周龄，对照组蛋鸡正常龙骨比例分别为60.00%、50.00%、47.38%、38.89%；龙骨弯曲比例为25.00%、21.43%、26.31%、23.33%；龙骨骨折比例为15.00%、28.57%、26.31%、27.78%。低钙组蛋鸡正常龙骨比例分别为25.00%、18.75%、15.38%、12.50%；龙骨弯曲组比例为43.75%、31.25%、30.77%、31.25%；龙骨骨折组比例为31.75%、50.00%、53.85%和56.25%。与对照组相比，低钙组蛋鸡龙骨损伤率明显增高且随产蛋鸡年龄增加，龙骨损伤发生率逐渐增加。

图1 对照组和低钙饮食组蛋鸡龙骨损伤率Fig.1 Keel damage rate of laying hens in control group(Con)and LCa group

2.2 龙骨微结构参数和骨密度

蛋鸡龙骨显微结构参数和骨密度见表2。与对照组相比，低钙组蛋鸡TV、BV、BV/TV、Conn.D.、Tb.Th、Tb.Sp、BS、BS/BV、DA、BMD差异显著（P<0.05），其中TV、Conn.D.、Tb.Sp、BS、BS/BV、BMD值降低，BV、BV/TV、Tb.Th、DA值增加。

表2 对照组和低钙饮食组蛋鸡龙骨显微结构参数和骨密度Table 2 Bone microstructure parameters and BMD of laying hens in control group(Con)and(LCa)diet group

续表

2.3 龙骨矿物质元素含量

蛋鸡龙骨中矿物质元素含量见表3。与对照组相比，低钙组蛋鸡钾、铁、铜、锶、钼、锰、锌、钒、硒、铊、铅含量增加（P<0.05），而钙、镍、锂、汞含量下降（P<0.05）。对照组和低钙组蛋鸡龙骨中其他元素含量差异不显著（P>0.05）。

表3 对照组和低钙饮食组蛋鸡龙骨矿物质元素浓度Table 3 Element concentrations of laying hens in control(Con)and low-calcium diet(LCa)groups

3 讨论

日粮钙水平对蛋鸡生产性能、蛋品质和骨骼质量起重要作用。骨质疏松症是蛋鸡骨骼问题主要原因之一，特别在产蛋高峰期，通常是由于日粮中钙缺乏引起。低钙饲粮饲喂蛋鸡，股骨和胫骨骨密度明显减小，说明低钙饮食加重骨质疏松，改变骨结构[16]。随蛋鸡产蛋周龄增加，骨骼中钙含量减少导致骨骼脆性增加，骨折风险增加[17]。研究发现，37周龄蛋鸡龙骨损伤特别是龙骨骨折发生率显著高于25周龄，表明龙骨骨折发生率随蛋鸡年龄增加而上升，且集中发生在产蛋初期至产蛋高峰期，50周龄后增长速度变缓[18]。饲喂含1.5%低钙日粮蛋鸡龙骨偏离和骨折发生率明显增高，表明添加1.5%有效钙日粮对笼养蛋鸡龙骨生长和健康有负面影响，可能与低钙日粮致蛋鸡骨骼密度降低，结构变化和骨骼元素稳态失衡有关。

Micro-CT作为骨健康评估工具，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、DA等关键结构参数可准确评估骨骼状态，反映骨骼质量。高数值BV/TV、Tb.Th、Tb.N及低数值Conn.D.和BS/BV与骨机械应变相关，Tb.Th与骨强度呈正相关[19]。此外，骨密度已成为骨折风险预测指标，可精确指示骨量变化，较低骨密度与较高骨损伤直接相关[20]。与对照组相比，低钙组蛋鸡龙骨微结构参数TV、Conn.D.、Tb.Sp、BS、BS/BV、BMD较低，而BV、BV/TV、Tb.Th、DA较高。在骨质疏松早期，DA值通常增加，BV、BV/TV值增加表示骨代谢水平升高，说明低钙日粮可诱导骨质疏松症。据报道，饲喂常规钙添加剂量日粮（3.7%）和高钙日粮（4.4%）蛋鸡比饲喂低钙日粮（2.62%）蛋鸡具有较强骨强度和更大骨密度[21]。

低钙（1.5%）饮食导致骨质疏松，骨质量和骨强度降低，同时引起蛋产量和蛋质量降低[16]，低钙饲粮诱导的骨质疏松常表现为骨量、宽度和强度大幅降低，骨小梁微结构变性[22-23]。蛋壳形成主要发生在夜间，此期间蛋鸡停止进食，蛋壳中钙主要通过肠道吸收，25%~40%由骨骼提供[24]，当饲粮中钙含量不足时，蛋鸡则通过吸收髓骨中钙保证蛋壳形成[25]。因此，日粮中钙含量较低促使蛋鸡骨密度降低，反映骨密度和骨强度的龙骨骨微结构参数也显著降低，抗骨折能力及骨强度下降，影响骨骼质量，导致龙骨骨折和弯曲发生率增加。

矿物质是组织和液体中普遍存在的无机营养物质，对维持人类和动植物某些物理化学过程非常必要。矿物元素（如钙、铁、磷）在骨矿化和代谢过程中发挥重要作用，如钙补充剂通过增加蛋鸡和肉鸡骨稳态、骨密度和骨强度改善骨质量。钙磷是骨骼发育最重要矿物质，钙磷缺乏导致骨量减少及骨结构改变，引发骨质疏松症[26]。试验发现，低钙日粮可降低蛋鸡龙骨中钙、锂、汞和镍含量，提高体内钾、铁、铜、锶、钼、锰、锌、钒、硒、铊、铅含量。某些矿物质元素包括钾、锰、铁、锌和硒对骨骼完整性和代谢均产生积极影响，当饮食中缺乏矿物质元素时对人和动物骨含量和骨质量产生不利影响[27]。研究发现，低钙组蛋鸡龙骨钾、铁浓度增加，这可能与膳食钙缺乏引起骨损伤修复有关。钾含量在骨折蛋鸡龙骨中升高可能与其成骨作用，促进骨折愈合有关[28]。

铁是骨骼健康和发育基本元素，参与多种代谢过程，铁过载或缺乏与骨吸收和形成不平衡导致的骨丢失呈正相关，反之说明平衡良好，骨稳态需最佳铁含量[29]。本研究中低钙饮食母鸡龙骨铁水平增加更可能促进骨吸收，导致骨损失和骨质量降低。锌、硒是骨骼生长发育重要元素，尤其在骨折愈合过程中发挥重要作用。本研究中锌、硒含量增加可能与低钙饲粮引起的龙骨骨折后愈合过程有关，骨折及其愈合期骨组织及其附着的肌肉组织发生炎症和氧化应激反应，需锌和硒等抗炎和抗氧化应激元素蓄积。锂元素促进骨折愈合，而本试验中低钙饲粮显著降低锂浓度，对龙骨骨折愈合产生不利影响。此外，铅和汞为有毒元素，低钙饮食蛋鸡铅含量增加对机体产生有害影响。综上所述，长期低钙日粮诱导蛋鸡龙骨骨元素浓度稳态失衡。