多年生和一年生荞麦根系生理特性比较研究

唐 彬，黄 娟，王璐瑗，陈庆富，荣玉萍，任蓉蓉

（贵州师范大学荞麦产业技术研究中心，贵阳550001）

人类粮食供给主要依赖于禾本科、豆科以及其他科一年生作物，如水稻、小麦、玉米、大豆、高粱、荞麦等，这些粮食作物生产模式存在劳动力缺乏导致土地荒废和过度依赖化肥农药造成农业生态系统破坏严重等亟待解决的问题，制约农业生产发展[1-3]。多年生作物是指可多年生长，或地上部分在冬季枯萎，次年继续生长和开花结实的作物[1]。多年生作物一方面可节约生产投入成本，减少劳动力使用，有效解决贫困山区土地荒废问题[2]；另一方面因多年生作物根系更发达，可加强对土壤水分和养分固定和利用，对土壤具有一定修复作用[1]。因此，多年生作物日益受到关注，多年生粮食作物育种研究在美国、澳大利亚、加拿大、中国等相继开展，涉及多年生小麦、多年生玉米和多年生水稻等多种作物[4-6]。

研究发现，一年生作物与多年生作物在根系拓扑结构和形态上存在差异，多年生作物根系更为粗壮和发达[5,7]。可越冬的多年生作物根系具备强大抗寒和再生能力，在生理水平上，抗寒能力主要表现在逆境胁迫相关保护酶活性，再生力主要表现在与植物生长发育相关的植物激素[8-10]。胡飞和刘铭铭报道称多年生玉米和一年生玉米在生长期间根系形态指标、可溶性糖和干物质积累以及根系解剖结构存在差异[5,11]。植物细胞内SOD、CAT和POD等抗氧化酶积累与植物抗寒性有关，在水稻、玉米和多年生小麦等多种植物上有报道[5-6,12]。此外，抗氧化物质谷胱甘肽（GSH）对维持低温胁迫下植物细胞膜结构完整性具有重要作用[8]。地下根茎再生是多年生水稻区别于栽培水稻的重要特征[13]，对多年生野生稻不同组织部位和再生根不同部位开展比对转录组分析，鉴定得到在多年生野生稻根中特异性表达基因，发现生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）和赤霉素（GA）等激素类基因可能在多年生水稻地下根再生和茎形成中具有重要调控作用[7]。

荞麦属于蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopy⁃rum），包括一年生荞麦如甜荞（F.esculentum）、苦荞（F.tataricum）和多年生荞麦如金荞麦（F.cymo⁃sum）等主要品种[14-15]。一年生甜荞和苦荞是目前主要栽培品种，其根系较短且侧根少，无法越冬，每个生长季均需种植，耗时耗力。多年生金荞麦根系膨大粗壮，可形成膨大块根，且侧根发达，可越冬，实现一次栽培，年年收获[2]。近年来选育的新种金苦荞是金荞麦与苦荞杂交后代，其地下根茎介于一年生荞麦和多年生荞麦之间，根系大于一年生荞麦且侧根发达，但不具有膨大块根。虽具一定越冬性，但在极其寒冷地区无法越冬[16]。一年生荞麦和多年生荞麦根系在形态上具有较大差异，但在生理水平上差异尚未见报道。

本研究以可越冬多年生荞麦、无法越冬一年生荞麦以及介于二者间具有部分越冬特性的金苦荞为研究对象，在其根系发育不同阶段，测定其他物种中报道的与多年生特性相关的3种内源激素（IAA、GA、CTK）含量和7种保护酶（SOD、CAT、POD、GPX、GR、GST、APX）活性，探究多年生荞麦和一年生荞麦在发育期内上述生理指标动态变化关系，明确多年生荞麦与一年生荞麦根中内源激素含量和酶活性差异关键时期，为从生理水平探讨多年生和一年生作物根系差异提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为两个一年生荞麦品种品苦1号（F.tataricum）和贵甜2号（F.esculentum）、两个多年生品种红心金荞（F.cymosum）和大野荞（F.megaspar⁃tanium）以及一个介于二者间的金苦荞（F.tatari-cy⁃mosum），由贵州师范大学荞麦产业技术研究中心保存并提供。

试验材料种植于贵州师范大学荞麦产业技术研究中心生长室，采取盆栽试验，所用土壤为黄土壤，采用常规栽培措施管理。在不同发育时期（四叶期、孕蕾期、初花期、盛花期）对荞麦地下根取样，每个样品至少取3株长势一致植株地下根，设置3次生物学重复。取样时将整株植株挖起，清水洗净根上泥土，用吸水纸轻轻擦干根表面水，一年生荞麦切取地下直根系，多年生荞麦切取地下膨大块根，取样后，根立即放入液氮中速冻，之后于-80℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 内源激素提取与测定

参照吴颂如等酶联免疫法（ELISA）[17]，略有改动。提取荞麦地下根中植物激素，提取方法为：称取样品0.1 g置于预冷研钵中，用80%甲醇溶液（内含10 mg·L-1丁羟甲苯BHT）研磨成匀浆，静置片刻后吸取上清液于离心管中，4 000 r·min-1离心15 min，取沉淀后用80%甲醇重复提取3次，合并上清液，即为激素萃取液。CTK、IAA和GA含量测定采用植物ELISA检测试剂盒（购自于上海优选生物科技有限公司），CTK试剂盒货号为YX032-011P，IAA试剂盒货号为YX-090101P，GA试剂盒货号为YX-070100P。3种激素测定方法按照试剂盒说明书操作。每份样品2次技术重复测定。

1.2.2 生理指标测定

1.2.2.1酶粗提液制备

酶粗提液制备方法参考Giannoplitis和Ries方法[18]，略有改动。样品在研钵中加液氮研磨至粉末，精确称取0.3 g样品，加入2 mL提取液（0.05 mol·L-1PBS缓冲液，pH 7.0，含2 mmol·L-1EDTA）于涡旋震荡仪上迅速匀浆，4℃下10 000 r·min-1离心15 min，取上清液，即为酶粗提液。

1.2.2.2生理指标测定

SOD活性测定分析参考Giannoplitis和Ries方法[18]，CAT活性分析参考Aebi方法[19]，POD活性分析参照Hendriks等方法[20]，GPX活性分析参考黄爱缨等方法[21]，GR活性分析参考Foyer和Halliwell方法[22]，GST活性测定按照GST活性测定试剂盒（YX-W-A204，购自于上海优选生物科技有限公司）方法，APX活性分析参考Chen和Asada方法[23]。每份样品2次技术重复测定。

1.3 数据处理与分析

利用Microsoft Excel 2019软件处理数据并绘表，利用SPSS 23.0作数据方差和相关分析。

2 结果与分析

2.1 多年生和一年生荞麦根系内源激素含量比较

2.1.1 生长素（IAA）含量比较

由表1可知，两个多年生荞麦（红心金荞和大野荞）IAA含量在孕蕾期到初花期明显下降，两个一年生荞麦（品苦1号和贵甜2号）IAA含量在发育时期呈逐渐上升趋势，金苦荞IAA含量无明显变化。多年生荞麦在四叶期和孕蕾期IAA含量显著高于一年生荞麦，随后在初花期急剧下降，一年生荞麦IAA含量在各个时期持续上升，表明多年生和一年生荞麦根系发育过程中IAA含量差异形成关键时期是初花期。5个品种中，红心金荞IAA含量在各发育期均显著高于其他品种。

表1 多年生和一年生荞麦不同发育期根系中IAA含量比较Table 1 Comparison of IAA content in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (ng·mL-1)

2.1.2赤霉素（GA）含量比较

由表2可知，两个多年生荞麦（红心金荞和大野荞）GA含量在孕蕾期到初花期明显下降，两个一年生荞麦（品苦1号和贵甜2号）GA含量在四叶期到初花期呈逐渐上升趋势，金苦荞GA含量在孕蕾期到盛花期呈上升趋势。多年生荞麦GA含量在四叶期到孕蕾期显著高于一年生荞麦，随后在初花期急剧下降，一年生荞麦在初花期GA含量呈上升趋势，表明多年生和一年生荞麦根系发育过程中GA含量差异形成关键时期是初花期。5个品种中，红心金荞GA含量在各发育期均显著高于其他品种。

表2 多年生和一年生荞麦不同发育期根系中GA含量比较Table 2 Comparison of GA content in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (ng·mL-1)

2.1.3 细胞分裂素（CTK）含量比较

由表3可知，两个多年生荞麦（红心金荞和大野荞）CTK含量在发育期无显著变化，一年生荞麦（品苦1号、贵甜2号和金苦荞）CTK含量波动幅度大，品苦1号从孕蕾期到初花期CTK含量大幅度上升，到盛花期又急剧下降，贵甜2号CTK含量呈先降后升趋势，金苦荞变化趋势与之相反。两个多年生荞麦（红心金荞和大野荞）CTK含量在各发育期均显著低于两个一年生荞麦（品苦1号和金苦荞）。多年生和一年生荞麦根系发育过程中CTK含量变化存在显著差异。

表3 多年生和一年生荞麦不同发育期根系中CTK含量比较Table 3 Comparison of CTK content in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (ng·mL-1)

2.2 多年生和一年生荞麦根系生理指标含量比较

2.2.1 SOD活性比较

如表4所示，两个多年生荞麦（红心金荞和大野荞）SOD活性变化趋势大致相同，均呈先增后降趋势，两个一年生荞麦（品苦1号和贵甜2号）呈先降后升再降趋势，金苦荞SOD活性在孕蕾期急剧下降，至初花期又大幅上升，之后无明显变化。除金苦荞外，多年生和一年生荞麦根系发育过程中SOD活性变化差异不显著。

表4 多年生和一年生荞麦不同发育期根系中SOD活性比较Table 4 Comparison of SOD activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (U·g-1)

2.2.2 CAT活性比较

如表5所示，多年生荞麦红心金荞和大野荞CAT活性呈先降再升趋势，一年生荞麦品苦1号和贵甜2号呈先升后降趋势，以上四种荞麦CAT活性变化波动幅度均较小，未达到显著性差异。金苦荞CAT活性变化与多年生荞麦变化趋势相同，但金苦荞波动幅度较大。

表5 多年生和一年生荞麦不同发育期根系中CAT活性比较Table 5 Comparison of CAT activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (nmol·min-1·g-1FW)

2.2.3 POD活性比较

如表6所示，多年生荞麦红心金荞和大野荞POD活性变化相同，四叶期到孕蕾期呈下降趋势，之后处于一个平稳状态，无明显增加或减少趋势。一年生荞麦金苦荞和品苦1号POD活性具有相似变化趋势，均呈先降后升再降趋势，贵甜2号呈先降后升趋势。各时期多年生荞麦根系中POD活性显著低于一年生荞麦，多年生荞麦和一年生荞麦根系POD活性变化在发育期存在显著差异，一年生荞麦POD活性在初花期出现上升趋势，多年生无明显变化，表明初花期是一年生荞麦和多年生荞麦根部位POD活性变化形成差异关键时期。

表6 多年生和一年生荞麦不同发育期根系中POD活性比较Table 6 Comparison of POD activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (nmol·min-1·g-1FW)

2.2.4 GPX活性比较

如表7所示，多年生荞麦中红心金荞GPX活性从四叶期到盛花期稳定上升；大野荞GPX活性呈先降后升趋势。一年生荞麦GPX活性变化波动较大，品苦1号呈先降后升再降趋势，变化幅度大；贵甜2号呈先降后升趋势，金苦荞呈先升后降趋势。多年生荞麦和一年生荞麦根系中GPX活性变化在发育期差异不显著。

表7 多年生和一年生荞麦不同发育期根系中GPX活性比较Table 7 Comparison of GPX activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (U·g-1·min-1 FW)

2.2.5 GR活性比较

如表8所示，多年生荞麦红心金荞GR活性呈先升后降再升趋势，大野荞呈先降后升趋势。一年生荞麦品苦1号和贵甜2号GR活性变化趋势接近，均呈先升后降再升趋势。金苦荞GR活性呈先降后升趋势，与大野荞变化趋势接近。多年生荞麦各个发育期根系中GR活性高于一年生荞麦，多年生荞麦和一年生荞麦根系中GR活性变化在发育期存在显著差异。5个品种中，金苦荞根系中GR活性在各发育期均低于其他品种。

表8 多年生和一年生荞麦不同发育期根系中GR活性比较Table 8 Comparison of GR activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (nmol·min-1·g-1FW)

2.2.6 GST活性比较

如表9所示，多年生荞麦红心金荞和大野荞GST活性变化趋势相同，变化幅度小，一年生荞麦品苦1号和贵甜2号GST活性均呈先升后降再升趋势，金苦荞各时期GST活性无变化。多年生荞麦各时期根系中GST活性显著低于一年生荞麦，多年生荞麦和一年生荞麦根系中GST活性变化在发育期存在显著差异，多年生荞麦红心金荞和大野荞GST活性在四叶期到初花期呈逐渐上升趋势，一年生荞麦在孕蕾期到初花期呈下降趋势，表明多年生和一年生荞麦根系发育过程中GST活性差异形成关键时期是初花期。

表9 多年生和一年生荞麦不同发育期根系中GST活性比较Table 9 Comparison of GST activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (nmol·min-1·mL-1)

2.2.7 APX活性比较

如表10所示，整个发育期多年生荞麦根系中APX活性显著低于一年生荞麦，多年生荞麦红心金荞和大野荞APX活性从孕蕾期开始变化趋势一致，差异不显著，且两者各个时期APX活性变化幅度小。一年生荞麦品苦1号和贵甜2号APX活性变化均呈先降后升再降趋势，金苦荞APX活性呈逐渐上升趋势，且从孕蕾期到初花期APX活性变化不明显。一年生荞麦APX活性在初花期呈上升趋势，多年生荞麦APX活性下降，表明初花期是一年生荞麦和多年生荞麦根部位APX活性变化形成差异关键时期。

表10 多年生和一年生荞麦不同发育期根系中APX活性比较Table 10 Comparison of APX activity in roots of perennial and annual buckwheat at different developmental stages (nmol·min-1·g-1FW)

2.3 多年生和一年生荞麦根系内源激素和生理指标相关分析

内源激素和生理指标相关性分析表明（见表11），IAA与GA含量呈极显著（P<0.01）正相关（R=0.814），与CAT活性呈显著（P<0.05）负相关（R=-0.454）；GA含量与GR活性呈极显著（P<0.01）正相关（R=0.602），与GST活性呈极显著（P<0.01）负相关（R=-0.669），与CTK含量（R=-0.446）、POD活性（R=-0.543）及APX活性（R=-0.489）呈显著（P<0.05）负相关；CTK含量与POD活性（R=0.720）及GST（R=0.609）活性呈极显著（P<0.01）正相关，与APX活性呈显著（P<0.05）正相关（R=0.451），与GR活性呈极显著（P<0.01）负相关（R=-0.730）；SOD活性与GPX活性呈显著（P<0.05）正相关（R=0.473）；CAT活性与POD活性（R=0.447）及GST活性（R=0.466）呈显著（P<0.05）正相关；POD活性与GST活性（R=0.773）及APX活性（R=0.700）呈极显著（P<0.01）正相关，与GR活性（R=-0.637）呈极显著（P<0.01）负相关；GR活性与GST活性（R=-0.755）及APX活性（R=-0.695）呈极显著（P<0.01）负相关；GST活性与APX活性（R=0.793）呈极显著（P<0.01）正相关。表明内源激素和指标间存在一定相关性，根据其相关性，可将其划分为3类，第一类为IAA、GA、GR，三者间呈正相关关系；第二类为CAT、CTK、POD、GST、APX，呈正相关；第三类为SOD和GPX，两者间呈正相关关系。其中第一类和第二类间呈负相关，且两类指标均与第三类无相关性。

表11 内源激素和生理指标相关分析Table 11 Correlation analysis of endogenous hormones and physiological indices

3 讨论与结论

植物生长发育受内源激素系统调控，对滇重楼、甘薯和多年生水稻等植物研究表明，植物内源激素（IAA、GA、CTK）在促进根茎和块根生长和膨大过程中发挥重要作用，在多年生地下根再生和茎形成中具有重要调控作用[7,24-25]。植物在受到低温伤害时，细胞膜发生膜脂过氧化，产生大量活性氧（如超氧阴离子和过氧化氢），导致质膜过氧化。此时，植物自身活性氧清除系统（如SOD、CAT、POD等）产生，以减轻活性氧对植物伤害。SOD是植物清除活性氧第一个酶，其催化超氧阴离子歧化生成氧气和过氧化氢。CAT、POD、APX等酶与过氧化氢发生反应将其清除[26]。对水稻、多年生玉米和多年生小麦研究表明，SOD、CAT、POD、GPX、GR、GST和APX等保护酶活性是评价植物抗寒性的重要指标，且植物抗寒性与越冬性强度相关，越冬性强品种其保护酶活性高于越冬性弱品种[5-6,12]。本研究多年生荞麦和一年生荞麦根系发育过程中，SOD、CAT、POD、GPX、GR、GST和APX等7种酶活存在显著差异，可能与多年生和一年生荞麦抗寒性差异有关，造成多年生与一年生荞麦越冬性存在差异。

在10个测试指标中，IAA、GA、POD、GST和APX等5个指标在初花期趋势出现转折，表明多年生和一年生荞麦根系差异关键时期可能在初花期。一年生荞麦需在当季完成开花结实，需用更多物质和营养开展生殖生长以完成其生命周期。多年生荞麦则将更多物质和营养用于根系生长，构建更加粗壮、高密和庞大根系组织，以抵御冬天寒冷[5,27]。初花期是植物从营养生长进入生殖生长转折时期，多年生和一年生荞麦根系在这一时期出现转折点，恰好印证上述结论。

相关分析将10个指标分成3种类型，第一类包含IAA、GA、GR等3个指标，第二类包含CAT、CTK、POD、GST、APX等5个指标，第三类包含SOD和GPX等2个指标。第一类指标和第二类指标存在显著负相关，主要表现为：第一类指标如IAA和GA含量在多年生荞麦根发育过程中高于一年生荞麦根，第二类指标如POD、GST和APX活性在多年生荞麦根发育过程中均低于一年生荞麦根。本文明确多年生荞麦和一年生荞麦在不同发育期内源激素和7个酶活指标动态变化关系及其差异关键时期，为从生理水平探讨多年生和一年生作物根系差异提供参考。