芪斛楂颗粒质量标准提升研究

2021-11-10安巧冯敏肖正会万科柳小兰王海波王道平

中国民族民间医药·上半月 2021年10期

安巧冯敏肖正会万科柳小兰王海波王道平

【摘要】目的：从不同产地和不同批次的原料药材中筛选出较优的原料药材，并建立芪斛楂颗粒的HPLC指纹图谱。方法：参考《中国药典》2015版及相关文献对陈皮、甘草、木瓜、等11味处方原药材进行成分检测和筛选，采用HPLC特征图谱技术，建立芪斛楂颗粒的指纹图谱分析方法，采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）进行相似度分析。结果：通过对芪斛楂颗粒指标成分含量测定结果，筛选出较优的药材来源。芪斛楂颗粒的HPLC指纹图谱共确定了16个共有峰，指纹图谱相似度均在0.9以上，并指认出2个共有成分（甘草苷，橙皮苷）。结论：所建立的方法简便、重复性好、稳定性好，可为芪斛楂颗粒的质量标准提升提供依据。

【关键词】

芪斛楂颗粒;含量测定;高效液相色谱法;指纹图谱

【中图分类号】R917 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）19-0040-06

Research on the Improvement of Quality Standard of Qihuzha Granules

AN Qiao1，2 FENG Min4 XIAO Zhenghui3 WAN Ke1，2 LIU Xiaolan1，2 WANG Haibo4 WANG Daoping1，2*

1. State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550014，China;

2. The Key laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences， Guiyang 550014，China;

3. Guizhou Medical University， Guiyang 550025，China;

4. Sunflower Pharmaceutical Group（Guizhou）Hongqi Co.，Ltd.， Liupanshui 550000，China

Abstract：

Objective This subject selects the better raw medicinal materials from different origin different batches of raw materials. To establish the HPLC fingerprint of Qihuzha Granules. Methods Reference the “Chinese Pharmacopoeia” in the 2015 edition and the literature methods， the content of active ingredients in citri reticulatae pericarpium， glycyrrhizae radix et rhizoma， chaenomelis fructus， ete， have been measured. The HPLC characteristic spectrum technology was usedto analyze the characteristic spectrum ofQihuzha Granules. The similarity ofthe species wasevaluated by using software“Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM”published by the State Pharmacopoeia Commission （2012A version）. ResultsIt has selected better medicines source through the results of measuring the content of the target composition. There were 16 common peaks in the HPLC chromatographic fingerprint of Qihuzha Granules， and 2 common components（Liquiritin， hesperidin） were identified. The similar degrees of 10 batches of samples were over 0.900. Conclusion This method is simple， repeatable， and stable. It provides basic data for improving the standand of Qihuzha Granules.

Key words：

Qihuzha Granules; Content Determination; HPLC; Fingerprint

芪斛楂顆粒是葵花药业集团（贵州）宏奇有限公司的独家品种，由黄芪、炙甘草、茯苓、石斛、山楂、党参、陈皮、白术等11味中药组成。具有健脾和胃、益气固表、消食导滞的功效，主要用于改善小儿脾胃气虚、脾失健运症引起的厌食、偏食、汗多、大便不调、易感冒等症状。临床研究发现，芪斛楂颗粒用于辅助治疗小儿急性上呼吸道感染[1]、治疗儿童营养不良合并反复呼吸道感染[2]、治疗小儿脾虚型腹泻[3]、治疗小儿厌食 [4-5]、婴儿腹泻[6]，疗效显著。

芪斛楂颗粒各药材来源产地较广，质量差异较大。复方中各处方原药材需要从源头进行优选和控制来保证芪斛楂颗粒优质有效，因此，在进行质量标准提升研究前需对各原料药品质进行检测。目前，芪斛楂颗粒的质量标准中，只对甘草酸铵有含量测定要求，尚未见文献报道其质量控制的方法。处方中11味原料药材所含化学成分组成复杂，个别成分的定性定量分析难以充分反映芪斛楂颗粒中所含化学成分的种类与数量。指纹图谱可较充分的反映出药物所含各种化学成分量分布的整体状况，可提高中药复方质量控制[7-9]，并为制剂药效物质基础研究奠定基础[10]。为更有效的控制制剂质量，确保其临床用药的安全、有效，本实验首次采用高效液相色谱法（HPLC）建立芪斛楂颗粒的指纹图谱，应用对照品对其主要特征峰进行指认，对复方化学成分指纹图谱色谱峰的归属进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪; KQ-300DA型数控超声波清洗器;ME104E/02电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）;EYELA-N-1100旋转蒸发器。

1.1.2 实验试药橙皮苷（批号110721-201316）、甘草苷（批号111610-201607）、甘草酸铵（批号110731-201720）、尿囊素（批号111501-200202）、齐墩果酸（批号110709-201808）、熊果酸（批号110742-201823）、白术内酯I（批号111975-201501）、白术内酯II（批号111976-201501）、白术内酯III（批号111978-201501）、党参炔苷（批号111732-201607）、黄芪甲苷（批号110781-201717），以上标准物质均购买自中国食品药品检定研究院。茯苓酸（批号PCS-181120）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号PCS-190417）、石斛酚（批号PCS-190616），购自成都植标化纯。儿茶素（批号161209）由Chengdu Purechem-Standard Co.，Ltd.提供。

黄芪、山药、炙甘草、茯苓、石斛、炒麦芽、山楂、木瓜、党参、陈皮、白术，均由葵花药业集团（贵州）宏奇有限公司提供;芪斛楂颗粒（样品批号：20190101、20190102、20190311、20190905、20190906、20190907、20190908、20190909、20190910、20190911），均由葵花药业集团（贵州）宏奇有限公司生产;甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），超纯水（由纯水/超纯水-一体机制备），乙腈（色谱纯，默克股份两合公司），其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 11味处方原药材有效含量参照文献[11-17]进行

1.2.2 色谱条件色谱柱为CAPCELL PAK C18 4.6mm×250 mm，5μm）;乙腈-水（A∶B）梯度洗脫：0～30 min，10%～40% A，30～50 min，40%～90%;50～60 min，90% A;流速1.0 mL·min-1，检测波长230 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

1.2.3 制备对照品取甘草苷、橙皮苷对照品适量，精密称定，以色谱甲醇为溶剂，分别制成含甘草苷、橙皮苷约0.1 mg·mL-1溶液。

1.2.4 制备供试品取芪斛楂颗粒约5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声提取30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量。摇匀，过滤，取续滤液25 mL，浓缩至干，用甲醇定容至5 mL容量瓶中，摇匀后用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得。

1.2.5 单味药及阴性供试品溶液的制备称取黄芪、葛根、陈皮及缺各单味药材复方阴性药材，按照各味药的处方配比与处方工艺提取制备，并按照1.2.3项下方法制备。

2 结果

2.1 11味中药材有效含量测定及品质评价 11味处方原料药材不同批次经过检测，结果如下：“陈皮20190603，陈皮20190601”中橙皮苷含量较高;“甘草JP-20180709，炙甘草20190101”中甘草苷、甘草酸含量较高;“茯苓JP-20180705，茯苓JP-20180706”中茯苓酸含量较高;“山药JP-20190501，山药JP-20190503”中尿囊素含量较高;“木瓜JP-20180803，木瓜饮片20190101”中齐墩果酸和熊果酸含量较高;“白术JP-20180801，白术（偏小）”中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的总量较高;“党参20190601，党参饮片20190101”中党参炔苷的含量较高;“黄芪JP-20180704，黄芪JP-20180707”中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷含量较高;“山楂JP-20180701，山楂JP-20180803”中枸橼酸含量较高;“麦芽20190502，麦芽20190503”中儿茶素含量较高;“流苏石斛JP-20180701，流苏石斛JP-20180702”中石斛酚含量较高。如图1所示。

由此可见，每味药材不同批次样品中有效成分的含量存在显著差异。

2.2 指纹图谱方法学考察

2.2.1 重复性试验取芪斛楂颗粒（批号：20190311），按1.2.4项下方法，平行制备供试品溶液5份，按1.2.2项下色谱条件，记录色谱图。以橙皮苷的色谱峰为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果表明，16个共有峰，相对保留时间RSD均低于0.4 %，相对峰面积RSD均低于5.0 %。

2.2.2 稳定性试验取芪斛楂颗粒（批号：20190311），按1.2.4项下方法制备供试品溶液，按1.2.2项下色谱条件，分别在0 h、2.5 h、5 h、10 h、15 h、20 h、25 h、30 h、48 h进样测定，记录色谱图。以橙皮苷的色谱峰为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果表明，16个共有峰的相对保留时间RSD均小于0.5 %，相对峰面积RSD均低于5.0 %，供试品溶液在48 h内基本稳定。

2.2.3 精密度试验取芪斛楂颗粒（批号：20190311），按1.2.4项下方法制备供试品溶液，按1.2.2项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。以橙皮苷的色谱峰为参照峰（S），计算16个共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果表明，16个共有峰，相对保留时间RSD均小于0.6 %，相对峰面积RSD均低于3.0 %。

2.3 芪斛楂颗粒液相指纹图谱建立及特征峰标定

2.3.1 芪斛楂颗粒HPLC指纹图谱的建立及评价取10批芪斛楂颗粒样品，按1.2.4项下方法制备供试品溶液，按1.2.2项下色谱条件，依次进样测定，记录样品色谱图。

将10批芪斛楂颗粒的HPLC图谱以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）软件，采用S1号样品（批号20190311）的指纹图谱作为参照图谱，时间窗宽度为0.50，中位数法，经多点校正自动匹配后生成芪斛楂颗粒共有模式对照指纹图谱;确认了16个共有峰。10批芪斛楂颗粒HPLC指纹图谱叠加图及对照指纹图谱如图2所示。

以共有模式对照指纹图谱作为参照图进行了相似度计算，10批芪斛楂颗粒样品与共有模式对照指纹图谱的相似度在0.985 ～ 0.999，各批样品的相似度较好。结果见表1。

2.3.2 芪斛楂颗粒复方与药材指纹图谱色谱峰相关性分析按1.2.4项下方法制备芪斛楂供试品溶液、药材对照溶液、芪斛楂颗粒阴性对照溶液，按1.2.2项下色谱条件，记录色谱图。利用色谱峰保留时间考察相关性，对芪斛楂颗粒HPLC指纹图谱的16个峰归属进行分析。

16个共有峰归属到各药材，其中14号峰来源于白术;2号、6号、14号峰来源于陈皮;4号、5号、7号、15号、16号峰来源于甘草;11号峰来源于黄芪;12号、13号峰来源于流苏石斛。

2.3.3 采用对照品法对芪斛楂颗粒指纹图谱各个色谱峰的指认根据芪斛楂颗粒HPLC指纹图谱共有峰和各味药材色谱峰的归属分析，有针对性的配制了甘草苷、橙皮苷对照品溶液，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。通过与对照品对比共指认了2个色谱峰，确认5号峰为甘草苷（如图3所示），6号峰为橙皮苷（如图4所示）。

在共有峰中，6号峰是芪斛楂颗粒中的主要活性成分之一，理化性质稳定，基线分离度好，故选为参照峰。

3 讨论

3.1 提取溶剂的考察本实验对提取溶剂进行筛選，分别用70 %乙醇、95 %乙醇、70 %甲醇、甲醇提取样品，结果采用70 %甲醇、甲醇提取所得的色谱峰均较好，为简便实验操作及方便溶剂回收利用，选择甲醇作为提取溶剂。

3.2 提取方法的选择本实验对提取方法进行考察，分别采用超声提取和回流提取样品，结果表明，超声提取和回流提取的结果无显著差异，为实验操作简便，选择超声提取;本实验对样品进行超声30 min、超声60 min提取，结果表明，使用甲醇超声30 min和甲醇超声60 min所得色谱峰一致，为了节约时间，选择甲醇超声30 min作为提取条件。

3.3 流动相的选择由于本样品中成分复杂，故采用梯度洗脱的方式，先后尝试甲醇-水、乙腈-水流动相系统，并且尝试了多种不确定的梯度条件，经过对各种色谱图的比较，最后确定乙腈-水为流动相，采用梯度洗脱，分离度理想，特征峰明显。

3.4 检测波长的选择取供试品溶液进样，采用二极管阵列检测器进行全波长扫描，并对各波长下的色谱图进行分析比较，芪斛楂颗粒大部分成分在230 nm有较大吸收，因此选择230 nm作为指纹图谱检测波长。

3.5 共有峰的归属比较复方与处方原料药材的色谱图发现，处方药材对共有峰的贡献为白术（14号峰）、陈皮（2号、6号、14号峰）、甘草（4号、5号、7号、15号、16号峰）、黄芪（11号峰）、流苏石斛（12号、13号峰）。所归属的色谱峰都能与药材和复方对应，有良好的相关性。14号峰的贡献来源于白术和陈皮。虽然有与茯苓对照药材相对应的色谱峰（16号峰），但在茯苓阴性样品的指纹图谱中也有该色谱峰，说明16号峰不是茯苓专属，仅与茯苓有关;虽然有与山楂对照药材相对应的色谱峰（1号、2号峰），但在山楂阴性样品的指纹图谱中也有该色谱峰，说明这两个色谱峰不是山楂专属，仅与山楂有关;未见与党参、麦芽、木瓜、山药有关的色谱峰，可能由于复方在煎煮过程中，成分之间相互发生作用导致成分转化或损失;其中3号、8号、9号、10号峰不能得到归属，可能是在制剂制备过程中11味药材共煎而产生的。综上所述，复方与处方药材的成分存在差异，两者之间并非简单的加和关系。本实验对复方成分的来源归属作了初步研究，为阐明芪斛楂颗粒的药效物质基础提供了依据。

本研究通过精密度试验、稳定性试验和重复性试验对芪斛楂颗粒HPLC指纹图谱方法进行了方法学考察，建立了芪斛楂颗粒HPLC指纹图谱，共标定16个共有峰，指认了其中2个色谱峰。采用所建立的方法对10批芪斛楂颗粒样品进行了指纹图谱测定，采用相似度分析方法对样品进行分析，结果显示，本研究建立的芪斛楂颗粒HPLC指纹图谱方法稳定、可靠、重现性好，可为葵花药业芪斛楂颗粒的质量标准提升提供依据。

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