黄芩苷对PCOS大鼠体内雌激素、CRP及卵巢组织中caspase-3表达的影响

蒋 荣， 刘国兵， 侯 静，吴 樱

(1.长沙市第三医院 妇产科，湖南 长沙 410000；2.长沙市第三医院 心血管内科，湖南 长沙 410000)

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种复杂的生殖内分泌综合征，雄激素过高是其在临床上的主要特征[1]。多囊卵巢综合征可导致内分泌出现严重紊乱，持续性无排卵，从而导致患者发生生殖障碍。据统计，在无排卵性的不孕症患者中，因PCOS而导致的不孕症占75%以上[2]。在临床上，PCOS主要表现为月经紊乱、高雄激素血症、低雌激素等症状。如果激素长时间都处于紊乱的状态，子宫内膜癌的发生率也会随着月经紊乱的时间延长而升高[3]。有学者研究发现，慢性的炎症反应也是导致多囊卵巢综合征的主要原因，PCOS的发生和发展与慢性炎症有着密不可分的关系[4]。C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)作为炎症反应中最为敏感的指标，CRP的含量越高，说明炎症反应越严重。研究发现CRP在正常人体内含量很低，但在受到损伤或感染的人体内CRP的表达就会明显升高，因此在临床上CRP也被认为是早期诊断疾病的指标[5]。有学者研究发现，在PCOS大鼠中，其卵巢窦状卵泡颗粒细胞出现大量凋亡，而半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)是细胞凋亡过程中的关键蛋白酶[6]。以上研究提示PCOS和体内CRP和caspase-3蛋白的表达有着密切的联系，目前对于PCOS的治疗还没有最为理想的方法。传统的治疗方法有腹腔镜下卵巢打孔术、药物促排卵以及药物抗雄激素等。但这些方法有的不仅会造成较大的手术创伤，治疗的效果也不理想，并且不能有效的预防多囊卵巢综合征的发生，其副作用也相对较大[7]。由此可见在妇科内分泌领域PCOS的治疗和预防仍是研究的热点。黄芩苷是黄芩中的有效成分之一，具有多种药理作用，如降压、镇静、抗菌、消炎等。有研究发现，黄芩苷在LPS诱导的小猪模型中通过NLRP3炎性体通路，发挥其抗炎作用[8]。但黄芩苷对PCOS炎症的影响还没有明确的研究，所以本文采用黄芩苷对PCOS大鼠进行干预治疗，并分析其对大鼠体内雌激素、CRP及caspase-3蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验所用的30只大鼠均来自上海斯莱克实验动物责任有限公司。所有大鼠健康并且没有任何的疾病，体重均在200～280 g之间，37℃的环境中对大鼠进行饲养，让大鼠适应7 d新的环境。

1.2 试剂和仪器 黄芩苷(西安赛德有机科技有限责任公司)；caspase-3抗体(美国CST公司)；C反应蛋白(CRP)和性激素试剂盒(上海博谷生物生物科技有限公司)；低温离心机(美国Sigma公司)；石蜡切片机(德国徕卡公司)；FA精密天平(上海诺科仪器仪表有限公司)。

1.3 动物分组与模型建立 把30只大鼠随机分为NC组(空白对照组：正常大鼠仅给予NaCl灌胃干预)、PCOS组(多囊卵巢综合征大鼠模型给予NaCl灌胃干预)，HQG组(多囊卵巢综合征大鼠模型给予黄芩苷灌胃干预)。建立PCOS大鼠模型，首先配置脱氢表雄酮，按照每100克大鼠6 mg的计量进行调配，并把脱氢表雄酮用大豆油稀释为0.2 mL的溶液。将配置好的脱氢表雄酮溶液分别颈背部皮下注射于PCOS组大鼠和HQG组大鼠，1天1次，连续对PCOS组和HQG组大鼠注射20 d。而NC组仅皮下注射大豆油，计量和注射次数同HQG组和PCOS组。用显微镜分别观察20 d后大鼠一个动情期的阴道涂片，当阴道出现连续的上皮角化，并且完整的动情期都消失时则代表PCOS模型制备成功。NC组和PCOS组大鼠给予NaCl灌胃干预，1次/d；HQG组大鼠给予50 mg/kg黄芪苷灌胃，1次/d，3组大鼠连续灌胃14 d。

1.4 标本采集 药物干预结束后，分别采集3组大鼠的尾静脉血液，将尾静脉血置入-80℃的冰箱中保存。分别处死NC组、PCOS组和HQG组大鼠，取出大鼠两侧的卵巢组织，并在天平上称取其总质量，固定后放置在-20℃的冰箱中保存备用。

1.5 大鼠体质量及卵巢质量的测定 对3组大鼠进行药物干预前和干预后分别测量其体重。处死大鼠后把大鼠两侧卵巢组织取出，并用精密天平称取大鼠双侧卵巢的总质量。

1.6 大鼠血清激素含量测定 分别取出3组大鼠2 mL的尾静脉血进行离心处理，取血清，检测血清中LH(黄体生成素)、T(睾酮)、FSH(卵泡刺激素)和E2(雌二醇)4种性激素的含量。

1.7 ELISA检测大鼠血清炎性因子含量 治疗14 d后，麻醉大鼠，取大鼠的静脉血离心处理，分离3组大鼠的血清，检测IL-6和CRP含量。

1.8 卵巢组织病理学形态观察 药物干预后，分别处死NC组、PCOS组和HQG组大鼠，把大鼠的卵巢组织分别取出，固定后用石蜡包埋切片，石蜡切片的厚度为4 μm，脱蜡后进行HE染色并进行观察。

1.9 Western blot检测大鼠卵巢组织中caspase-3蛋白的表达 将3组大鼠的卵巢组织分别提取100 mg，将细胞进行裂解并提取核蛋白，并对核蛋白的浓度进行测量，分装后，保存在-20℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均，按照4∶1的比例进行，将蛋白溶液煮沸处置，变性。在电泳板内注入50 μg蛋白样。全部转移到PVDF膜上，再把脱脂奶粉加入，全程封闭时常为1 h。把一抗加入孵育后用TTBS进行洗涤，洗涤后把二抗加入，孵育1 h后取出PVDF膜，再次洗涤后用DAB进行显色，最后数码相机拍照。

1.10 RT-PCR检测大鼠卵巢组织中caspase-3 mRNA的表达 把保存在-80℃环境中卵巢组织取出。将液氮冷冻中的卵巢组织进行研磨，用Trizol裂解后对总的RNA进行提取，将逆转后所得的cDNA进行荧光反应实验。所有反应严格按照反应的条件进行扩增，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环。取得到平均值后得到Ct值，计算方法用2-△△Ct法进行分析，引物序列见表1。

表1 引物序列表

2 结果

2.1 3组大鼠体质量和卵巢质量比较 在干预前PCOS组大鼠和HQG组大鼠的的体重显著高于NC组(P<0.05)，而PCOS组大鼠和HQG组大鼠的体重无统计学差异(P>0.05)；干预后，PCOS组大鼠的体重明显高于NC组大鼠，HQG组大鼠的体重显著低于PCOS组(P<0.05)。PCOS组大鼠的卵巢质量明显高于NC组大鼠，而HQG组大鼠的卵巢质量显著低于PCOS组(P<0.05，见表2)。

表2 3组大鼠干预前后的体重比较和卵巢质量比较

2.2 3组大鼠血清中激素含量比较 与 NC组相比较，PCOS组大鼠血清中LH、T和E2含量显著升高，而性激素FSH的含量显著降低(P<0.05)；干预后的HQG组大鼠性激素水平得到了明显的抑制，同时FSH的含量显著升高(P<0.05，见表3)。

表3 3组大鼠血清中激素含量比较

2.3 3组大鼠血清中炎性因子含量比较 PCOS组大鼠血清中CRP的含量明显高于NC组大鼠，经过黄芩苷干预治疗后的HQG组大鼠血清中炎性因子CRP含量显著降低(P<0.05)，见表4和图1。

表4 3组大鼠血清中炎性因子CRP含量比较

2.4 3组大鼠卵巢组织形态变化比较 NC组大鼠的颗粒细胞均能完整显示，均排列整齐，细胞无变性和坏死，无炎性因子浸润，在卵巢的髓质中无充血及水肿出现。与NC组相比，PCOS组大鼠的组织形态出现明显的改变，PCOS组大鼠的卵巢组织中出现严重的弥漫性扩张，出现了大量的囊腔且大小不一，粒层细胞受到了严重的挤压，形状也极为不规则，黄体大量减少，发育阶段卵泡数量降低。黄芩苷治疗后的HQG组大鼠的卵巢组织形态得到了明显的改善(见图2)。

*：与NC组相比，P<0.05；#：与 PCOS组相比，P<0.05。图1 3组大鼠CRP含量比较

A：NC组；B：PCOS组；C：HQG组；HE染色，×400。图2 3组大鼠卵巢组织染色结果

2.5 Western blot检测大鼠卵巢组织中caspase-3蛋白表达 与NC组相比较，PCOS组大鼠卵巢组织中caspase-3蛋白明显增多(P<0.05)；经过黄芩苷干预后的HQG组大鼠卵巢组织中caspase-3蛋白的表达显著减少(P<0.05，见图3～4)。

图3 3组大鼠卵巢组织caspase-3蛋白表达

2.6 RT-PCR检测3组大鼠卵巢组织中caspase-3 mRNA的表达 与NC组比较，PCOS组大鼠的caspase-3 mRNA表达量显著升高(P<0.05)；而HQG组大鼠表达量得到了显著的降低(P<0.05)，见表5和图5。

*：与NC组相比，P<0.05；#：与PCOS组相比，P<0.05。图4 3组大鼠卵巢组织中caspase-3蛋白比较

表5 3组大鼠caspase-3 mRNA的表达(n=10)

*：与NC组相比，P<0.05；#：与PCOS组相比，P<0.05。图5 3组大鼠caspase-3 mRNA的表达比较

3 讨论

多囊卵巢综合征(PCOS)是内分泌综合征中的一种，主要特征为雄激素过高和无排卵[8]。PCOS的发病机制十分复杂，目前其T水平和LH水平过高，FSH水平过低，卵巢组织中出现大量的卵泡及由于间质出现增生而导致的不排卵特征已形成共识。LH在正常情况下会和卵泡膜上的LH受体相结合，产生以T和雄烯二酮为主的雄激素[9]。FSH通过促进窦前卵泡和其颗粒细胞的增殖和分化，促进细胞的生长和发育，直至细胞成熟为止。同时FSH会结合颗粒细胞上的FSH受体，进而让雄激素转化为雌激素。有研究显示在PCOS患者体内雌二醇和雌酮的水平均降低[10]。虽然目前PCOS的发病机制仍然存在较大的争议，但激素的紊乱、慢性炎症反应已达成了学者们的共识，激素的紊乱和慢性炎症反应之间相互作用，严重影响着疾病的发生。有学者研究发现，和健康人相比，PCOS患者血清中的CRP含量显著升高[11]。黄芩是常用的中药之一，其性寒味苦，能清热燥湿、泻火解毒、止血，为清热燥湿常用药物。黄芩提取物能抑制炎性渗出，通过降低毛细血管通透性、抑制组织胺和乙酰胆碱的释放等降低炎症反应造成的损伤。本文旨在研究PCOS大鼠的性激素水平和炎性因子含量的变化，并用黄芩苷进行干预治疗，分析黄芩苷对PCOS大鼠雌激素变化及CRP和caspase-3蛋白的影响。

本文建立PCOS大鼠模型，研究结果显示PCOS组大鼠的体重和卵巢质量均显著高于NC组，干预后的HQG组均得到了明显的抑制。和NC组相比较，PCOS组大鼠血清中LH、T和E2含量显著升高，而性激素FSH的含量显著低于NC组；HQG组大鼠的LH、T和E2均得到明显的抑制，同时FSH的含量显著得到提升，提示黄芩苷可能通过降低大鼠的体重，减少脂肪的累积，从而抑制血清中T的含量。PCOS属于一种亚临床的炎性反应，和临床上的急性或慢性的炎症反应所表现出的红肿等不同，PCOS的发生没有任何的身体症状[12]。亚临床的炎性反应一般会损伤全身的毛细血管内皮，从而导致动脉粥样化，胰岛素β细胞受到损伤的同时出现胰岛素抵抗，让卵巢发生损伤，导致多囊样改变，进而使激素的分泌出现异常。本研究发现PCOS组大鼠血清中炎性因子CRP的含量明显升高，CRP在HQG组大鼠中得到了明显的改善，提示黄芩苷可有效的降低PCOS中CRP的含量，同时还能改善大鼠卵巢的组织形态。黄芩是常用的清热解毒中药之一，其主要有效成分是为黄酮类化合物，尤其是其中的黄芩苷、黄芩素等，已被证明具有广泛的药理活性。除了传统意义上的抗菌、抗感染、消炎、解热、保肝之外，近年来对其抗氧化、抗肿瘤、神经保护等药理作用的研究日趋深入[13]。顾琼琼等[14]通过对动物实验研究显示，黄芪苷能降低动脉粥样化大鼠血清中TAFI、hs-CRP以及IL-6炎性因子的表达，从而改善大鼠的动脉粥样硬化。王敏等[15]通过对动物实验研究显示，黄芩苷能降低血清中炎性因子CRP的含量，同时抑制肿瘤坏死蛋白的表达。

Caspase家族能有效的调控细胞的凋亡，也能对促细胞凋亡的分子进行诱导[16]。Caspase-3是细胞凋亡途径下游的关键蛋白酶，正常情况下caspase-3一般以没有活性的酶原形式存在，但出现细胞凋亡时，就会被剪切为诱惑性的片段，从而介导着细胞的凋亡[17-18]。本研究显示，caspase-3蛋白在PCOS组大鼠中高表达，可见PCOS组大鼠中有大量的颗粒细胞凋亡，由此提示caspase-3的级联反应可导致颗粒细胞大量的凋亡。经过黄芩苷治疗后的HQG组大鼠中caspase-3蛋白和mRNA的相对表达量都显著降低，可见黄芩苷可显著降低PCOS大鼠颗粒细胞的凋亡。黄芩苷对变态反应有不同程度的抑制作用。由于黄芩具有很好的药效和相对较低的毒性，在临床上得到了越来越多的关注。靳楠楠等[19]对大鼠脑缺血再灌注损伤研究中发现，其保护机制在于黄芩苷可降低Bcl-2和caspase-3蛋白的表达。周颖璐等[20]研究发现，黄芩苷可减少小鼠卵巢组织中caspase-3蛋白的表达，有效的拮抗卵巢出现的氧化损伤。

综上，黄芩苷可增加血清中雌激素的表达，抑制炎性因子CRP表达，同时减少卵巢组织中caspase-3蛋白的表达，进而影响多囊卵巢综合征的发生、发展。