松辽黑猪NR5A2 基因内含子6 多态性及其与繁殖性状的关联分析

张云鹏，高 一，张 琪，刘庆雨，张 庆，张净博，张树敏*

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130124；2.吉林省农业科学院，吉林长春 130124；3.公主岭国家农业科技园飞马斯牧业有限公司，吉林公主岭 136100）

核受体5A 亚家族，也被称为FTZ-F1 家族，因为果蝇中的福氏Tarazu 片段基因是该基因家族的创始成员[1]。受体5 亚家族有4 个成员NR5A1A（ff1b）、NR5A1B（ff1d）、NR5A2（ff1a）和NR5A5（ff1c）[2]。核受体亚家族5，A 组，成员2（NR5A2），又称肝受体同系物-1，是孤儿核激素受体的一员，在胰腺、肝脏、肠道和卵巢中高表达[3]。NR5A2位于1 号染色体q32.1[4]，它控制着一组在正常生理和疾病中都很重要的基因的表达。除了在发育过程中起重要作用外[5]，NR5A2还调节许多与新陈代谢、增殖和细胞存活相关的基因。在肝脏，NR5A2调节胆汁酸的生物合成[6]和胆固醇的反向运输[7]，影响肝脏和循环中的胆固醇水平。并且，NR5A2调节葡萄糖代谢，其中包括葡萄糖转运蛋白4（GLUT-4)介导的转运[8]和葡萄糖磷酸化，后者对于正确的餐后血糖感觉、糖酵解和糖生成途径的过程以及脂质新生是必不可少的[9]。NR5A2是通过影响细胞保护相关基因来调控应激反应[10-11]。此外，NR5A2可在某些癌症中过表达，并可通过雌激素受体和β-连环蛋白信号转导，促进肿瘤生长[12]。

最近，NR5A2被证明是小鼠子宫内膜中的一个重要调节因子，对成功妊娠至关重要[13]，并且它似乎是下丘脑促性腺激素分泌的上游调节因子[14]。在小鼠卵巢中，NR5A2在卵巢中表达，仅限于卵巢原代卵泡和所有后续卵泡的颗粒细胞[15]。NR5A2对于颗粒细胞增殖是必不可少的，但是它的消耗不会改变细胞凋亡的频率或自噬，表明NR5A2是卵巢颗粒细胞增殖的关键调节剂[16]。

本研究以经产松辽黑猪母猪为实验对象，用Sanger直接测序法检测松辽黑猪NR5A2基因内含子6 多态性，分析不同基因型与繁殖性状的关联性，以期为松辽黑猪繁殖性能的提高和遗传标记的筛选提供一些参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 随机挑选130 头松辽黑猪母猪进行保定，用耳缺钳取耳组织大约1.5 g，放入装有75%酒精的2 mL离心管中，记录母猪耳标号，依次标记离心管，-20℃保存备用。样品分别取自于吉林省农业科学院和吉林省公主岭市飞马斯牧业有限公司。

1.2 主要试剂及仪器 2×Taq Master Mix 购自北京康为世纪生物科技有限公司；基因组DNA 提取试剂盒购自Axygeno 公 司；Lightcycler®480 HRM MasterMix 试 剂盒购自Roche 生物公司。超微量分光光度计Quawell-Q5000 购自北京鼎盛生物技术有限责任公司；电泳仪、凝胶成像分析仪购自北京市六一仪器厂；PCR 仪T100购自上海伯乐生命医学产品有限公司。

1.3 基因组DNA 提取 取-20℃保存的耳组织，使用DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，每个DNA 样品使用Quawell-Q5000 超微量分光光度计检测浓度及纯度，并记录备用。1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，挑取质量合格的DNA 样品，-20℃冰箱保存。

1.4 引物设计及合成 根据GenBank 中发表的NR5A2基因DNA 序列（登录号：NC_A0A287APH6.3），用Primer5.0 软件设计引物，引物序列为F：5'-CATTATCC TCCATCCTGTTC-3'；R：5'-CAGACACTCGGAGGTTG G-3'，预计扩增片段390 bp。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5 PCR 扩增及SNP 位点检测 随机挑选松辽黑猪40 个耳组织DNA 样品，分8 组进行混池，以此为DNA 模板，对NR5A2基因6 个内含子进行PCR 扩增。PCR 反应体系20 μL：2×Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 8 μL，上下游引物各0.5 μL（0.5 μmol/L），DNA 1 μL（＜300 ng/50 μL）。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸12 s，共34 个循环；72℃延伸8 min；4℃保存。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，取符合要求的PCR 产物送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。

1.6 统计分析 基因频率是指某种基因在一个种群中所出现的百分比；基因型频率是指某种特定基因型的个体占群体内全部个体的百分比。通过基因（型）频率计算遗传纯合度（Ho）、有效等位基因数（Ne）、多态信息含量（PIC）和遗传杂合度（He）。

式中：n为等位基因数，Pi、Pj为第i、j 个等位基因频率；PIC＜0.25 为低度多态，0.25＜PIC＜0.5 为中度多态，PIC＞0.5 为高度多态。

利用SPSS 19.0 软件分析不同基因型与松辽黑猪繁殖性状相关性，结果表示为“平均值± 标准差”，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 PCR 产物扩增效果 由图1 可知，扩增片段长度约为390 bp，与预期片段大小相一致。

图1 NR5A2 基因内含子6 引物PCR 扩增产物

2.2 目的片段PCR 产物测序结果分析 松辽黑猪NR5A2基因PCR 产物测序结果通过DANMAN 和Chromas 软件与NCBI 公布的NR5A2基因组DNA 序列进行比对。结果显示，在NR5A2基因第6 内含子发现1 个SNP 位点（由T 突变为C，命名T23C），共有3 种基因型，分别命名为TT、TC 和CC。序列比对及SNP 位点分析结果见图2、图3。

图2 松辽黑猪NR5A2 基因内含子6 序列比对结果

图3 松辽黑猪NR5A2 基因内含子6 不同基因型测序图

2.3 松辽黑猪NR5A2基因型频率和基因频率 由表1可知，在T/C 位点，TT、TC 和CC 基因型频率分别为4.62%、37.69%和57.69%；T 和C 基因频率分别为23.47% 和76.53%。其中CC 基因型为优势基因型，C为优势等位基因。卡方适合性检验结果显示，松辽黑猪T23C 位点符合Hardy-Weinberg 平衡状态（P＞0.05）。

表1 松辽黑猪NR5A2 基因内含子6 基因型频率和基因频率

2.4 松辽黑猪NR5A2基因群体遗传特异性 由表2 可知，在T23C 位点，遗传杂合度（He）为0.359 2，相对较低；多态信息含量PIC 为0.294 7（0.25＜PIC＜0.5），表现为中度多态。

表2 松辽黑猪NR5A2 基因T/C 位点的遗传多样性

2.5NR5A2基因多态性与松辽黑猪繁殖性状的关联分析由表3 可知，在T23C 位点上，TT 基因型的总产仔数、产活仔数及断奶仔猪数均最高，其中总产仔数及产活仔数TT 基因型显著高于CC 基因型，断奶数TT 基因型均显著高于TC 及CC 基因型；各基因型仔猪初生重，3 周龄重、断奶重及乳头数无显著差异。

表3 松辽黑猪NR5A2 基因内含子6 不同基因型与繁殖性状的相关性

3 讨论

NR5A2在哺乳动物卵巢中的表达仅限于活化卵泡的颗粒细胞；在卵泡发育过程中颗粒细胞中的卵丘扩张是必不可少的；卵泡体细胞中NR5A2的破坏不影响卵母细胞胞质内单精子注射受精的能力[17]。NR5A2是排卵必不可少的多个过程所必需的，并且调节子宫蜕膜化，对妊娠至关重要[15]。这表明，NR5A2对于雌性动物的卵泡形成和妊娠是必不可少的。本研究通过Sanger 直接测序对NR5A2基因内含子6 进行SNP 位点检测，第一次在松辽黑猪群体中发现NR5A2基因内含子6 序列存在T/C 突变，并检测到3 种基因型分别是TT、TC、CC，其中CC 为优势基因型、基因型频率最高，等位基因C 为优势基因。本实验研究发现，NR5A2基因突变位点He 相对较低，表明其在松辽黑猪群体中的遗传变异偏低，有可能是样本群体数量太少，但PIC 为0.294 7（0.25＜PIC＜0.5），表现为中度多态，说明该SNP 位点能够提供少量的遗传信息。对T23C 位点与松辽黑猪繁殖性状关联分析发现，该位点TT 基因型总产仔数及产活仔数显著高于CC 基因型，断奶数均显著高于TC及CC 基因型。初生重、3 周龄重及断奶重CC 基因型均高于TT 基因型及TC 基因型，CC 基因型又为优势基因型，但无显著性差异。

另外，Li 等[18]研究发现，NR5A2的表达水平与湖羊的排卵和产羔数有关；Kaluarachchi 等[19]研究发现，在人类中NR5A2基因的多态性与早产有关；Meinsohn 等[20]研究发现，NR5A2在颗粒增生和卵泡生长中起作用。Labelle-Dumais 等[21]发现杂合小鼠（NR5A2+/-）的繁殖力显著降低。Duggavathi 等[15]通过使用由Amhr2（NR5A2Amhr2-/-）引导的Cre 重组酶小鼠株系，初级卵泡颗粒细胞中缺少NR5A2阻止了黄体的形成，表明NR5A2对卵丘扩张、排卵和雌性生育是必需的。而本研究发现，NR5A2基因内含子6 的TT 基因型和产仔数性状有相关性，与前人研究结果趋同，进一步证实了NR5A2基因在调节雌性动物繁殖性能方面起着重要作用，说明NR5A2基因的多态性可能影响松辽黑猪繁殖性状。

然而，目前学界对NR5A2基因的研究还只是局限于研究调节胆固醇稳态、类固醇生成、组织特异性细胞增殖、干细胞多能性及一些肿瘤上的过表达，在动物遗传育种领域的研究报道较少。由于本研究检测的群体数量太少，后续将扩大松辽黑猪群体数量进一步研究，以验证NR5A2基因内含子6 对松辽黑猪繁殖性状是否存在影响。

4 结论

本研究对松辽黑猪NR5A2基因内含子6 进行了PCR 扩增及Sanger 直接测序，经分析检测出1 个SNP位点（T23C），共有3 种基因型。该突变位点在松辽黑猪群体中处于Hardy-Weinberg 平衡状态，属于中度多态（0.25＜PIC＜0.5），能提供少量遗传信息。松辽黑猪NR5A2基因内含子6 突变位点（T23C）不同基因型之间总产仔数、活仔数及断奶仔猪数具有显著差异，其中TT 基因型为有利基因型，这一结果为母猪群的选留提供了一定参考，但能否作为松辽黑猪母猪繁殖性状的遗传标记还需在更多、更大的群体中进一步验证。