益生菌通过肠-脑轴调控动物骨代谢的研究进展

余 洋，曾新福，乐 敏，杨彩梅*

（1.浙江农林大学动物科技学院·动物医学院，浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室，浙江临安 311300；2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江安吉 313300；3.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058）

骨代谢是指骨吸收与骨形成的动态平衡过程，其中成骨细胞（Osteoblast，OB）与破骨细胞（Osteoclast，OC）在保证骨量正常中起着重要作用。OB 负责骨基质的合成、分泌和矿化，OC 主要吸收骨基质。OB 的分化受多种因素影响，如干细胞抗原1（Sca-1/Ly-6A）、激素、胰岛素样生长因子1（Insulin-Like Growth Factors -1，IGF-1）等，其调节涉及Wnt/catenin 和转化生长因子-β/骨形态发生蛋白介导的信号通路之间复杂的相互作用。OC 的关键因子主要有核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）配体受体激活因子（Receptor Activator of Nuclear Factor-Kappa B ligand，RANKL）和单核细胞集落刺激因子（Macrophage Colony-Stimulating Factor，M-CSF）2 种。其中，RANKL 又称肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）相关激活诱导细胞因子，它通过激活NF-κB 受体激活物（Receptor Activator of NF-κB，RANK）直接控制分化过程。

此外，免疫系统细胞（如B、T 细胞）产生的大量细胞因子，如白细胞介素-1（IL-1）、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子（TNF-α）等，也可通过调节OC 和OB上RANK 和RANKL 的表达，或调节RANK 介导的细胞内信号而间接发挥作用[1]。骨代谢相关生化指标，如1,25-羟基维生素D3、甲状旁腺素（PTH）、降钙素（CT）、血钙、血磷等，均可直接或间接调节骨代谢，进而影响骨的钙化或溶解[2]。

肠道微生物是指存在于动物肠道中的数量庞大的微生物群体。肠道微生物中包含部分益生菌，其可调节肠道菌群的整体代谢，进而增强屏障功能、免疫调节及肠道神经的调节功能[3-5]。目前，关于益生菌通过肠-脑轴影响骨代谢的讨论越来越热，但其具体功能机理仍然未知，在禽类生产上此类研究较少。本文基于肠-脑轴综述了益生菌对禽骨代谢的影响，为益生菌研究及其对禽类规模化养殖提供参考。

1 影响骨代谢的因素

1.1 钙、磷 影响骨代谢的因素包含各个方面，钙磷稳态是维持骨强度的主要因素。如禽类中，不同比例的钙磷添加对OC 的形成及活化呈不同程度抑制作用，影响禽类骨骼强度[6-7]。在小鼠试验中，钙磷水平调节PTH的分泌及维生素D 的合成，PTH 变化影响RANKL mRNA 表达受体激活剂的分泌，影响OC 的形成和活化，达到调节骨量作用[8]。而益生菌与血清钙水平呈正相关，对提高细胞吸收钙有显著作用[9]，表明益生菌可能参与骨代谢。

1.2 维生素 维生素D 及维生素K 影响骨骼形成。胆钙化固醇及其代谢物可促进软骨细胞成熟，预防胫骨软骨发育不良，改善肉鸡骨骼的钙沉积，进而提高生产性能，降低死亡率，口服补充益生菌罗伊氏乳杆菌可提高血清25-羟基维生素D 水平[10-12]，维生素K 促进骨折愈合和骨生成，肠道菌群合成的维生素K2转运到肝外组织后，再通过活化骨钙素（Osteocalcin，Ocn）抑制NF-κB 表达调节基质GLA 蛋白、血管和软骨钙化抑制剂，进而抑制OC 形成，促进OB 生成[13]。

1.3 激素 PTH 作为甲状旁腺的主要分泌物，一方面增加活性维生素D 的产生，促进肠道钙吸收，并协同肾脏减少钙排泄以达到提升血钙水平；另一方面通过与基质或OB 上的甲状旁腺素受体1（Parathyroid Hormone Receptor 1，PTHR1）结合来刺激OC 形成，从而增加RANKL 和M-CSF 的受体产生并抑制RANKL 结合骨保护素[14]，含有瑞士乳杆菌的发酵乳可使绝经后妇女血清PTH 降低，减少其绝经后骨吸收[15]。

CT 虽然是响应于血钙变化进行调节，但它和PTH一样，可直接作用于软骨细胞刺激其钙化，且可通过其受体与依赖性环磷酸腺苷-蛋白激酶A（cAMP-PKA）偶联来抑制OC 骨吸收[16]。虽然目前关于益生菌影响家禽此类激素的研究较少，但已有关于添加益生菌改善骨质量的研究[17]，该激素可作为检测骨代谢的指标之一。

骨钙素（Ocn）作为评价骨形成和骨转换率的一种标志，由OB 产生并分泌，经γ-羧化后存储于细胞外基质。Ocn 可在参与能量代谢后反馈性影响OB 中的胰岛素信号传导，活化OC，影响骨代谢[18]。此外，Ocn可调节神经递质的合成，促进海马区神经发生过程，进而影响大脑的认知功能（防止焦虑和沮丧，改善学习和记忆）[19]。而雄性小鼠口服Ocn 试验也证明其可显著提高血清Ocn 水平，增加骨密度[20]。综上，Ocn 似乎是肠-脑-骨轴链接的重要物质之一。

2 肠-脑-骨轴

脑-肠轴和肠-脑轴是指肠与大脑之间的双向通讯。脑-肠轴是指大脑通过自主神经元和神经内分泌因子传递输出信号到肠道。而肠-脑轴是指肠道以感觉神经元、免疫介质（如细胞因子）、肠道激素和肠道菌群衍生的信号分子将信息从肠道传递到大脑[21]。二者联系的介质较多，如乙酰胆碱（Ach）、γ-氨基丁酸（GABA，中枢神经系统的主要抑制性神经递质）、5-羟色胺（5-HT，又称血清素）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）等，本文就其研究较多的部分进行简单梳理。

2.1 肠源性介质 5-HT 作为一种单胺类神经递质，95%是由肠嗜铬细胞（EC）利用色氨酸羟化酶1（TPH1，在周围表达）产生[22]。念珠菌和大肠埃希氏菌也可利用食物中色氨酸产生5-HT[23-24]。已有研究证明，5-HT可通过调节RANKL 或直接活化NF-κB 来调控破骨细胞分化[25]，且不同的5-HT 受体亚型对骨的作用有所差异，肠源性5-HT 可以影响Wnt/β-catenin 信号的LRP5（低密度脂蛋白相关蛋白5）对骨形成的调节[26]。

短链脂肪酸是联系肠-脑轴的一个非常重要的介质。益生菌可通过短链脂肪酸影响免疫系统，进而调控IL-6、IL-17、RANKL 等的表达，达到调节骨代谢的作用[27]。Lucas 等[28]开展的3 种独立试验进一步验证了短链脂肪酸可改变破骨细胞的代谢状态，且对绝经后骨质丢失及关节炎有显著缓解作用，这表明短链脂肪酸含量变化是贯穿肠-脑-骨轴调节的关键。

2.2 脑源性介质 交感神经支配骨髓调节造血功能和干细胞稳态，从大脑发出的交感神经信号通过肾上腺素能神经纤维传递到骨髓，影响神经递质释放。外周5-HT无法直接穿过肠脑屏障作用于中枢，但基因敲除小鼠的色氨酸羟化酶2（在脑中表达）的试验证明了脑源性5-HT可以通过5-HT2c 受体作用于下丘脑腹内侧核神经元，调节肾上腺素（E）分泌，以减少交感神经活动，从而调节骨量[29]，说明脑源性5-HT 可以作为骨代谢调节因子参与骨转换，并猜测肠源性5-HT 可能间接影响这一过程。

NE 属于儿茶酚胺的一种，主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素能神经末梢合成和分泌，其变化往往可以体现菌群变化对机体代谢的影响。最新的研究揭示了肠道菌群与NE 通过环磷酸腺苷-蛋白激酶A-反应元件结合蛋白（cAMP-PKA-pCREB）信号通路相互作用，调节能量代谢[30]，且交感神经激活后释放的NE 可负面调节骨量[31]，这些均涉及下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴，揭示神经递质在肠-脑-骨轴中的调节不可或缺。

3 益生菌对肠-脑轴的影响

益生菌作为活的微生物，其益生作用早已得到研究者的一致认同，且其对肠道疾病（传染性腹泻、抗生素

相关性腹泻、炎性肠病、肠易激综合征、乳糖不耐症等）的预防、治疗效果也早已被证明[32]。而益生菌对于肠-脑轴的作用也在大量试验中开始明晰，它不仅能使肠道菌群正常化，还可使涉及肠-脑轴调控的行为或疾病得到改善。如益生菌可以使母体分离后的小鼠HPA 正常化[33]，在抗焦虑作用上可单独通过迷走神经促进肠脑沟通，降低皮质酮水平，促进大脑中GABA 的表达正常化[34]。此外，研究通过对重排活化基因敲除（Rag1-/-，缺乏发育成熟的B 和T 淋巴细胞）小鼠使用益生菌后，发现小鼠行为障碍和结肠生理学变化得到改善，证明了益生菌可使免疫缺陷小鼠的肠-脑轴正常化[35]。相关机制或涉及神经传导，或涉及免疫系统，均表明益生菌对肠-脑轴的作用是多途径同时进行。

3.1 益生菌对神经递质的影响 益生菌调节肠-脑轴的方式大致可以分为代谢、免疫、神经递质3 种，而神经递质中的生物原胺类（单胺类，包含吲哚胺中的5-HT和儿茶酚胺中的E、NE、DA）和氨基酸类（GABA、组胺、谷氨酸、Ach 等）研究最多。

3.1.1 单胺类 E、NE、DA 和5-HT 都是激素和兴奋性神经递质，是作为激素存在而发挥神经递质的作用，虽然没有直接证据证实它们可穿过肠脑屏障作用于中枢神经，但早前的大量研究证实肠道菌群可产生与抑郁症有关的神经递质GABA[36]，乳酸杆菌可合成DA[24]，且无菌动物试验发现，无菌小鼠的盲肠腔和组织中的NE 水平显著低于正常小鼠，并且盲肠中NE 的水平可以通过微生物群落或46 种梭状芽胞杆菌混合物的定植来恢复[37]，说明益生菌可介导宿主体内的这些激素调节而影响中枢神经。O’Mahony 等[38]也指出，胃肠微生物可通过直接利用色氨酸调节胃肠道中局部5-HT 浓度，继而影响肠-脑轴神经传递。

3.1.2 氨基酸类 胆囊收缩素（CCK，一种胃肠激素），在周围神经系统和肠神经系统中大量产生，并且主要参与情绪和食物摄入的调节。在人和小鼠中，CCK 水平与增加的焦虑样行为呈正相关[39]。研究表明，CCK 可通过神经递质（包括谷氨酸、5-HT、Ach 和GABA）的关键作用来调节情绪障碍[40]。而乳酸杆菌可产生Ach[24]，拟杆菌属可产生GABA 且其丰度与大脑抑郁症特征负相关[36]。虽然相关的具体作用机理仍在探索中，但基于益生菌在相关疾病中的作用已被证明，益生菌通过影响神经递质来影响神经系统的途径值得进一步探究。

3.2 益生菌对细胞因子的影响 益生菌对宿主免疫影响并不是直接作用于相关的细胞免疫因子，而是通过其代谢物影响细胞因子，进而与宿主的免疫调节能力相关联。肠道微生物与炎症细胞因子反应显著相关，具体表现为微生物色氨酸代谢物——色胺醇与TNF-α和干扰素（IFN-γ）的产生相关，而与其他细胞因子（如IL-1β、IL-6 和Th17 衍生的IL-17 和IL-22）关联程度较低，但更具特异性[41]。此外，肠道中色氨酸的代谢物还可通过与芳基烃受体相互作用介导免疫反应，进而抑制炎症[42]，这些不仅仅是对宿主机体的免疫调节非常重要，对机体的大脑也有影响，因为细胞因子在介导免疫信号的同时，可进入血液而影响血脑屏障缺陷的部位（如下丘脑）。Murray 等[43]的对比实验验证了这一点，益生菌可改善脂多糖（LPS）处理青春期小鼠的细胞因子及下丘脑室旁核中TLR4 的表达。

3.3 益生菌对免疫因子的影响 益生菌对免疫的影响主要是通过其代谢产物实现肠道免疫，如短链脂肪酸、色氨酸代谢物、B 族维生素等。丁酸可以与G 蛋白偶联受体GPR109A（G-Protein Coupled Receptor 109A，在结肠上皮细胞和先天免疫细胞中表达）特异性结合并诱导Treg 细胞（调节性T 细胞）分化，丙酸对肠固有层的巨噬细胞的组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）活性及炎性介质（NO、IL-6、IL-12）的分泌有抑制作用[44]，它们影响着促炎与抗炎机制之间的平衡，是益生菌与宿主免疫系统交流的重要手段。

色氨酸代谢物中的吲哚是肠道免疫中最有效的产物，其主要作用是通过降低TNF-α介导的NF-κB 活化，减少促炎因子IL-8 的表达并增加抗炎因子IL-10 的表达；此外，吲哚及其衍生物对维持黏膜稳态、增加细胞紧密连接、增强肠上皮屏障亦有作用[45]。

益生菌可产生其宿主不能产生的维生素[46]，尤其是B 族维生素，对机体的免疫调节非常重要，如B1是三羧酸循环的关键因子，B2与相关蛋白结合，可特异性激活MAIT 细胞（一种先天样T 细胞），进而可能对IFN-γ、IL-17 分泌产生影响[47-48]。

4 益生菌对骨代谢的影响

4.1 益生菌通过调节营养吸收影响骨代谢 肠道菌群在食物消化、能量利用、矿物质吸收及维生素供应等方面均与宿主相互作用，进而影响宿主骨骼代谢。益生菌不仅可合成维生素B 和维生物素K[46]，大量的动物试验证明益生菌（包括乳酸菌、双岐乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌等）还可通过合成维生素、调节肠道pH、胆汁酸代谢等途径影响钙吸收；此外，肠道作为矿物质吸收的主要场所，可直接受益生菌影响，调节机体对钙磷的吸收，进而影响骨骼[49]。这些证据均表明益生菌可影响宿主骨骼代谢，也说明益生菌或可为骨骼相关疾病的治疗找到契机。

4.2 益生菌通过生长因子及激素调节骨量 副乳杆菌或乳杆菌混合物可治疗小鼠雌激素缺乏引起的骨丢失[50]。而雌激素可通过调节产生TNF-α的T 细胞数量影响M-CSF 诱导和RANKL 诱导的OC 生成，达到调节骨量的作用[51]。研究表明，饲粮中添加地衣芽孢杆菌可显著调节蛋鸡雌激素分泌，并上调编码雌激素及雌激素相关受体基因表达[52]。另外，长双歧杆菌也已被证明可使卵巢切除大鼠的骨转化指标正常化[53]。在肉鸡上，枯草芽孢杆菌用于生产可提高肉鸡血清Ocn 水平，增加胫骨强度[54]，已知IGF-1 是一种多能生长因子，可通过内分泌、自分泌和旁分泌作用促进破骨细胞、成骨细胞和软骨细胞分化，常规生长的新生小鼠的生长激素和IGF-1 水平高于无菌小鼠，且植物乳酸菌可部分消除营养不良状态下外周组织对生长激素的抗性[55]。说明益生菌可通过影响生长因子及激素水平来影响骨骼健康。

4.3 益生菌通过介导免疫反应影响骨代谢 Sjögren 等[56]的试验显示，对3 周龄无菌小鼠进行正常肠道菌群定植，可以提高其全身免疫力继而使骨量正常化。益生菌还可直接通过其代谢物影响机体免疫。研究显示枯草芽孢杆菌产生的细菌多糖可介导发育中免疫系统的细胞成熟，弥补无菌小鼠脾脏中CD4+T 细胞的缺陷[57]，鼠李糖乳杆菌对营养不良状况下小鼠的免疫功能有增强作用，影响免疫缺陷小鼠的骨重塑[58-59]，这意味着益生菌对于宿主健康的作用不仅仅在预防疾病方面，在逆转不良影响方面也有价值。

目前，畜牧方面已有不少学者指出益生菌可明显影响生产动物骨骼参数及生产性能，如枯草芽孢杆菌可改善蛋鸡骨骼性状、产蛋性能和蛋壳品质[60-61]。低含量非植酸磷的日粮中添加酵母亦有利于其骨骼钙化[62]。尽管关于益生菌作用的具体机制仍在探索中，但它为进一步研究益生菌影响畜禽骨代谢提供了有价值的信息。

5 应用展望

综上，可发现肠-脑轴是联结益生菌与骨代谢的重要通路，而短链脂肪酸和单胺类神经递质是影响肠-脑轴的关键，未来可着重探究相关具体机制，如丁酸如何通过肠-脑轴影响骨代谢通路、5-HT 怎样介导肠-脑-骨轴联系、益生菌产生的色氨酸是否直接介导骨代谢途径等。相信这些深入的机制研究不仅可在相关疾病的治疗方面发挥重要作用，也将为进一步探索畜禽高效养殖提供理论依据，同时推动益生菌在畜禽养殖上的应用，提高生产动物经济效益，促进养殖业高效发展。