艾灸调节肉瘤微环境中Th1/Th2漂移的作用*

李丽君，廖群好，骆敏翔，何丽娇，王 坤，赵昌林△

(1．广东祈福医院，广东 广州 511495；2.广东药科大学，广东 广州 510006)

软组织肉瘤是少见的间叶组织恶性肿瘤，在初诊时14.5%～26.5%的患者就已经远处转移，40%～50%的局限性病灶会出现远处转移，肉瘤的低发病率和多样性亚型限制了开展大规模、特异性的临床研究[1-2]。目前，化疗仍然是晚期软组织肉瘤治疗的标准，其他治疗方法效果仍不确定[3]。艾灸是利用艾叶产生的热量作用于特定穴位或部位，通过刺激经络来调节内脏器官的功能，达到治疗疾病的目的[4]。艾灸常用于恶性肿瘤的姑息治疗[5-7]。

辅助T淋巴细胞主要分为Th1、Th2、Th17和Treg共4个类型。Th1细胞分泌白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子，调节细胞免疫，在抗肿瘤中起重要作用。Th2细胞分泌IL-4、IL-10等细胞因子，介导体液免疫，促进抗体产生。正常情况下，Th1和Th2细胞亚群维持相对稳定，维持免疫平衡[8]。当恶性肿瘤形成时，Th1和Th2细胞亚群平衡紊乱，Th1/Th2平衡左漂移，抑制机体的抗肿瘤免疫[9-10]。如果纠正Th1向Th2漂移，则具有抗肿瘤的作用。本项研究以S180肉瘤移植瘤为模型，研究热敏艾灸对肉瘤微环境中Th1/Th2平衡的调节作用。

1 材料与方法

1.1 动物

C57BL/6J小鼠，SPF级，35～42 d，雌雄各40只；昆明小鼠，SPF级，16～18 g，28～30 d，雌雄各10只，均购自广东省医学实验动物中心[生产许可证号：SCXK(粤)2013-0034]。实验小鼠适应性喂养1周，室温(24±2)℃，相对湿度50%～70%，实验过程遵守科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。S180肉瘤细胞株购自广东省医学实验动物中心。本实验经广东药科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 热敏艾条(南阳绿莹艾草生物制品有限公司);顺铂(山东齐鲁制药公司);BSA、蛋白酶K和DAPI(武汉Servicebio公司);anti-DIG-HRP(美国Jackson公司);Mouse Premixed Multi-Analyte Kit(美国Luminex公司，LXSAMSM-7);CD4(PE-CY7-A)、IFN(PE-A)和IL-4(APC-A)购自(美国eBioscience公司)。

1.2.2 主要仪器 悬液微珠芯片平台Luminex® 200TM(美国Luminex公司)；正置荧光显微镜(日本尼康，Nikon Eclipse ci)；成像系统(日本尼康，Nikon DS-U3)；流式细胞仪(美国BD公司，FACS Aria)；原位杂交用载玻片、涡旋混匀(武汉Servicebio公司)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司)。

1.3 分组与模型制备

C57BL/6J小鼠按照完全随机法分为空白组、模型组、顺铂组和艾灸组，雌雄各半，每组10只。复苏S180肉瘤细胞株，接种于昆明小鼠腹腔形成腹水，取腹水离心，调整细胞浓度1×107/mL，取0.1 mL接种于C57BL/6J小鼠胸部皮下，形成移植瘤。在接种4 d后，局部可见突起，触摸为硬结节，病理检查证实移植瘤，作为造模成功的标准。

1.4 干预方法

1.4.1 艾灸组 接种第6天开始给以艾灸治疗，以移植瘤为治疗穴位，使用热敏艾条直接灸移植瘤，距离3 cm，每次艾灸10 min，每日1次，连续干预14 d为一疗程。

1.4.2 模型组 接种S180细胞形成移植瘤，不进行干预。

1.4.3 顺铂组 按照小鼠体重4 μg/g给药，在接种第6天开始给予腹腔注射，共3次为一疗程。

1.5 检测指标及方法

治疗1个疗程后处死小鼠，取血清进行细胞因子检测，测量移植瘤的重量，通过流式细胞检测分析脾淋巴细胞的Th1和Th2细胞亚群，移植瘤进行病理分析，Fish检测Th1和Th2的基因表达。

1.5.1 细胞因子检测 样品孵育，取微珠在振荡器上振荡30 s，超声30 s，使用Assay Diluent RD1W 稀释微珠；取50 μL标准品与 Background加入96孔板中。取25 μL样品加入96孔板中，并加入25 μL Calibrator Diluent RD6-52稀释样品。避光，室温孵育120 min。孵育检测抗体，每孔加入50 μL Detection Antibody，室温避光孵育60 min。弃去检测抗体，洗涤3次。每孔加入50 μL Streptavidin-PE，室温避光孵育30 min。每孔加入100 μL Wash Buffer重悬，放置在平板摇床上850 rpm，室温避光振荡2 min,送入Luminex®200TM机器中读值。

1.5.2 流式细胞检测 脾剪碎，分离淋巴细胞。加红细胞裂解液约2 mL，裂解2 min。取30 mL淋巴细胞分离液，将裂解后的悬浮细胞缓慢加在淋巴细胞分离液上，离心。取中间层淋巴细胞离心15 min。每个样本分别加CD4 PE-CY7-A 1.25 μL、IFN PE-A 1.25 μL和IL-4 APC-A 2.5 μL。检测对照组加CD90-FITC，室温避光孵育30 min。上机检测。

1.5.3 Fish检测 移植瘤组织固定，脱水，切片，石蜡切片脱蜡至水。消化，预杂交：滴加预杂交液，37℃孵育1 h。杂交：滴加含探针杂交液，浓度 6 ng/μL，恒温箱37℃杂交过夜。滴加封闭血清BSA。滴加鼠抗地高辛标记过氧化物酶(anti-DIG-HRP)。滴加CY3-TSA试剂，避光室温反应5 min。DAPI复染核，镜检拍照。探针：TH1-m probe:5′-DIG-TCTCC GGCGG CGTTG GCCTG GTCTC ACT-DIG-3′。Th2-m probe:5′-DIG-TCGGC GAAGG CGCTG TTGAT GCTCT G-DIG-3′。Fish结果判定：计算100个肿瘤细胞数，查看阳性表达率。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组S180肉瘤移植瘤比较

各组HE染色分析，细胞呈暗色嗜酸性染色，胞浆和染色细胞核紧密相连，证实为S180肉瘤，见图1。 结果表明，艾灸组移植瘤的重量低于模型组，与顺铂组比较无统计学意义，模型组的均数为(2.45±0.23)g，艾灸组为(1.54±0.18)g，顺铂组为(1.97±0.20)g。艾灸组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，艾灸组与顺铂组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1 S180肉瘤移植瘤HE染色

注：与模型组比较,#P<0.01。图2 各组移植瘤重量比较(n=10)

2.2 各组血清IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-4的浓度

Th1分泌IL-2、IFN-γ，Th2分泌IL-4和IL-10等细胞因子，艾灸组可提高血清IL-2和IFN-γ的浓度，降低IL-10和IL-4的浓度。见表1。

表1 各组血清IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-4浓度比较

2.3 各组脾淋巴细胞中Th1和Th2细胞的数量比较

以CD4和IFN-γ为标记进行Th1细胞亚群的检测，见图3，艾灸增加荷瘤小鼠Th1细胞亚群的数量，见表2。以CD4和IL-4为标记进行Th2细胞亚群的检测，见图3，艾灸组具有下调移植瘤小鼠Th2细胞亚群数量的作用，见表2。

注：A为各组Th1细胞亚群数量的比较;B为各组Th2细胞亚群数量的比较。图3 各组脾淋巴细胞Th1和Th2细胞数量比较

表2 各组脾淋巴细胞中Th1和Th2细胞的数量比较

2.4 各组移植瘤微环境中Th1和Th2基因表达的比较

S180肉瘤移植瘤微环境中Th1基因的表达率为41.8%，顺铂组19.1%，艾灸组87.5%，与模型组比较，艾灸组Th1基因表达增加，差异具有统计学意义(P<0.01)，与顺铂组比较，艾灸组Th1基因表达增加，差异具有统计学意义(P<0.01)，艾灸上调Th1的基因表达。见图4。

注：A为各组移植瘤微环境中Th1基因表达，红色荧光；B为各组移植瘤微环境中Th2基因表达，红色荧光。图4 各组移植瘤微环境中Th1和Th2基因表达

S180肉瘤移瘤微环境中Th2基因的表达率为45.5%，顺铂组50.1%，艾灸组16.3%，与模型组比较，艾灸组Th2基因表达下降，差异具有统计学意义(P<0.01)，与顺铂组比较，艾灸组Th2基因表达下降，差异具有统计学意义(P<0.01)，艾灸下调Th2的基因表达。见图4。

与模型组比较，顺铂组Th1/Th2比例向Th2偏移，差异具有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，艾灸组Th1/Th2比例向Th1偏移，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图5。

注:与模型组比较，*P<0.05，#P<0.01。图5 各组移植瘤微环境中Th1/Th2比例比较

3 讨论

在肉瘤微环境中，Th1/Th2比例向Th2漂移。临床研究表明，宫颈癌或宫颈上皮肉瘤病变患者Th1细胞比例较低，Th2、Th17和Treg细胞比例较高，宫颈癌患者IL-4、IL-10、IL-17、IL-23和TGF-β1血清浓度增加，而INF-γ血清浓度下降；宫颈癌或宫颈上皮肉瘤病变存在Th1/Th2和Th17/Treg失衡[9]。Th1数量升高，改变Th1/Th2失衡和血清IL-6浓度下降是肝癌预后良好的标记物[11]。肿瘤微环境中包括复杂的T细胞亚群网络，通过相关矩阵的层次聚类，确定与Th17 (RORC，IL-17A)、Th2 (IL-4，IL-5，IL-13)、Th1 (IRF1，IL-12Rb2，STAT4)和细胞毒性(GNLY, GZMB, PRF1)相关基因的功能簇，Th17基因高表达的患者预后较差，而Th1基因高表达的患者无病生存期较长[12]。结直肠癌的进展与Th1/Th2的失衡有关，Th1/Th2失衡向Th2漂移与Dukes分期下降有关[13]。通过流式细胞学检测，正常小鼠脾的Th1/Th2的比例为6.59:1；在S180肉瘤模型中，Th1/Th2的比例为1.66∶1，出现明显的Th2偏移。在S180移植瘤的模型中，血清IL-2和IFN-γ的浓度明显下降，IL-10和IL-4的浓度明显升高，证实在S180移植肉瘤微环境中Th1/Th2比例出现Th2偏移。

化疗抑制肿瘤生长，Th1/Th2向Th2偏移。研究表明，肺癌化疗后CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+比值均明显下降，是导致肺部感染等的主要原因[14]。笔者使用顺铂进行干预，对S180移植瘤重量检测，模型组的均数为2.455 g，顺铂组为1.972 g。顺铂可以控制肉瘤的生长，但是其导致Th1/Th2的比例更加漂移，正常小鼠脾的Th1/Th2的比例为6.59∶1；顺铂干预组比例为0.91∶1，出现明显的Th2偏移，IL-10和IL-4的浓度明显升高。结果表明顺铂抑制肿瘤生长，导致Th1/Th2向Th2偏移。

艾灸具有抑制S180移植瘤的作用。对晚期恶性肿瘤患者在常规治疗基础上艾灸双侧足三里，每日1次，生存质量评分较治疗前提高，在乏力、气短、纳呆食少、头晕目眩、面色、心悸、腰膝酸软方面及总分的改善优于对照组，艾灸足三里能有效调节恶性肿瘤晚期患者免疫平衡，改善症状[15]。艾灸对癌症出现的恶心和呕吐具有治疗作用[16]。将S180肉瘤细胞移植到雌性小鼠乳房皮下组织中，艾灸治疗的平均生存时间为87.8 d，对照组为60.2 d[17]。通过对每组的S180移植瘤进行重量检测，艾灸组的抑制率为59.9%，顺铂组24.5%，艾灸具有抑制180移植瘤的作用，其效果优于顺铂。

艾灸通过纠正Th1/Th2偏移起抑制肿瘤的作用。谭静等研究艾灸对胃荷瘤大鼠Th1、Th2表达的影响，艾灸组第1 d悬灸中脘、关元和双侧足三里，第2日悬灸双侧脾俞及胃俞。艾灸组抑制率达41.89%，瘤体内Th1类细胞因子TNF-α、INF-γ含量增加，Th2类细胞因子IL-6、IL-22含量减少[18]。艾灸干预动脉粥样硬化降低动脉粥样硬化指数，影响Th1/Th2的漂移偏向，调整体液免疫与细胞免疫的平衡[19]。麦粒灸可有效调节荷瘤小鼠的免疫功能，促进荷瘤小鼠Th1型细胞因子的产生，有效纠正荷瘤导致Th1/Th2的失衡[20]。许焕芳等观察艾燃烧生成物对SAMP8小鼠血清Th1/Th2细胞因子的影响，模型组小鼠血清IFN-γ水平显著高于正常组，而IL-4水平则显著低于正常组，艾烟通过对Th1/Th2细胞因子平衡的调节而起到抗衰老作用[21]。

本研究表明，正常小鼠脾的Th1/Th2的比例为6.59∶1；在S180肉瘤模型中，比例为1.66∶1，通过艾灸治疗后，其比例为10.49∶1，出现明显的Th1漂移，对恶性肿瘤导致的Th1/Th2向Th2偏移具有纠正作用。艾灸治疗可以提高移植瘤小鼠血清IL-2和IFN-γ的浓度，下调IL-10和IL-4的浓度；分析肿瘤微环境中Th1和Th2基因的表达，艾灸上调了Th1基因表达，下调Th2基因表达，表明艾灸通过纠正Th1/Th2漂移起抑制肿瘤的作用。

综上所述，艾灸可抑制S180移植瘤的生长，通过调节肿瘤微环境中Th1/Th2的比值，使其由Th2漂移向Th1漂移，从而具有抗肿瘤的作用。