基于VEGF/VEGFR通路针灸治疗子宫内膜异位症痛经的临床研究*

孙可丰，何美蓉，欧诒菲，时思毛，李 娜，李晓晓，张重芳，孔德敏，周俐君

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

子宫内膜异位症简称内异症(Endometriosis，EMs)，是近年来妇产科最为常见、疑难的疾病之一[1]。主要临床表现包括经行腹痛渐进性加重、慢性盆腔疼痛、性交痛、不孕和月经不调等。研究发现87.7%EMs患者有痛经[2]。疼痛是EMs患者就诊时诉求医生缓解或消除的主要问题之一，这也是临床工作中需要面临解决的难题。西医临床治疗EMs通常为手术与药物治疗，国内外大量的临床研究显示单纯依靠手术或激素类药物治疗EMs的预期效果均不理想，且复发率高[3]，多数年轻、有生育要求的女性患者，更倾向于寻求中医保守治疗。中医针灸治疗在此方面显示出了很大的优势。临床研究显示中医针灸可显著改善EMs临床痛经症状，疗效得到患者一致的肯定。但目前针灸治疗EMs痛经具体作用机制却尚无统一的研究结果。研究表明EMs是一种血管生成依赖性疾病，异位的内膜易附着并种植在卵巢及腹腔内。异位内膜的种植及生长需血管提供营养物质，在促进血管的形成方面，血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是调控及促进血管生成最强的因子[4]，它可以诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，是生理及病理性血管生成过程中必不可少的生长因子。血管内皮生长因子受体(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor,VEGFR)可通过胞外结构域与VEGF结合形成同源或异源二聚体，在受体细胞特定区域发生作用，然后最终传递至细胞核内，从而引发内皮细胞的一系列变化实现VEGF的生物学效应[5]。故本研究拟从血管新生角度为针灸治疗EMs痛经作用机制提供临床研究基础，通过观察电针对血清VEGF、VEGFR表达的影响以及临床痛经积分、证候评分等改变，试阐述电针治疗EMs痛经的作用机制，为针灸治疗EMs痛经提供理论依据及对日后VEGF/VEGFR信号传导通路在本病的研究进行初步探查，以期为针灸治疗本病的作用机制提供临床研究基础，为治疗EMs提供新的思路。

1 临床资料

1.1 一般材料

2016年8月—2019年12月黑龙江中医药大学附属第一医院妇科门诊收治的20～40周岁EMs痛经(寒凝血瘀证)患者80例，所有病例均符合本研究的纳入标准及排除标准，获得患者知情同意后，根据随机数字平均分成试验组和对照组两组，各40例。试验组年龄22～40岁，平均平龄(32.65±4.53)岁；病程2～10年，平均病程(4.09±1.99)年。对照组年龄21～40岁，平均平龄(31.83±4.67)岁；病程1～9年，平均病程(3.98±2.15)年。两组患者年龄和病程等资料比较，差异无统计学意义(P>0.05),满足研究对比要求。另外，选择10例正常健康女性为空白组。

1.2 诊断标准

1.2.1 中医诊断标准 参照1993年中国卫生部发布的《中药新药临床研究指导原则》[6]“中药新药治疗盆腔子宫内膜异位症的临床指导原则”中“子宫内膜异位症中医诊断与辨证标准”拟定：①月经前后少腹、腰骶部有不适或疼痛，逐渐加剧；②盆腔病理包块、结节；③舌质紫或舌体瘀斑、瘀点；④固定性刺痛并拒按。具有以上主要依据①～②和③～④项之一，即可诊断。

1.2.2 中医辨证标准 参照2002年国家药品监督管理局发布的《中药新药临床研究指导原则》[7]及“十二五”规划教材《中医妇科学》(第9版)[8]相关内容并结合临床拟定寒凝血瘀型中医证候标准。寒凝血瘀证：经前、经期小腹冷痛拒按，得温痛减，或性交痛、小腹坠胀痛，月经周期后延，经血量少，经行不畅，色暗或夹有血块，畏寒肢冷，面色青白，带下量多，色白，大便稀，舌黯或有瘀点、瘀斑，苔薄白或腻，脉沉紧。

1.2.3 西医诊断标准 根据丰有吉主编《妇产科学》(7版)[9]、贺丰杰主编《中西医临床妇产科学》[10]相关标准拟定。(1)①渐进性痛经；②经前或经后的某一固定时间内下腹部疼痛、腰骶不适进行性加剧；③进行性加剧周期性直肠刺激症状；④月经量多、经期延长；⑤子宫均匀性增大或局限性隆起，质地硬伴压痛，且经期压痛更甚；⑥子宫峡部或有触痛性结节；(2)B超：子宫增大，肌层回声不均匀，可见条索状低回声或散在点状强回声图像,提示子宫内膜异位症；(3)血清CA125水平轻、中度升高。临床表现凡有①、②中的1项和③～⑥中1项，结合B超和CA125即可临床诊断。

1.3 纳入标准

①符合中医及西医诊断标准；②年龄20～40周岁，月经周期规律；③痛经积分≥5分；④血清CA125<80 IU/L，>35 IU/L；⑤包块直径<4 cm的患者；⑥知情同意，志愿受试者。

1.4 排除标准

①原发性痛经或其他疾病导致的痛经者；②局部或全身性恶性肿瘤者；③正在参加其他临床试验者；④既往有严重药物过敏史；⑤合并有心血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病；⑥精神病患或无自主判断能力者；⑦哺乳期、妊娠妇女及近6个月内准备妊娠者；⑧未按规定治疗，无法判断疗效或资料不全等影响疗效或安全性判断者。

2 方法

2.1 治疗方法

2.1.1 试验组 电针+中药，电针取穴选择气海、关元、气穴、太溪、大赫、子宫穴和地机穴，针灸时协助患者选择仰卧位，常规75%的酒精棉球进行皮肤常规消毒后，选择毫针迅速进针，腹部穴位针刺时向会阴部方向进针，下肢穴位垂直进针，一般刺4～7 cm，接电针，频率20 Hz，选连续波，强度1～4 mA，以患者忍受为度，得气后留针时间为30 min，出针后用消毒干棉签按压针孔片刻。每周3次，月经期停针，合计治疗3个疗程。

中药痛必宁冲剂(黑龙江中医药大学附属第一医院院内制剂)，每次1袋，每日3次，经前7 d开始服用，至月经第3天停止，连续服用3个月。痛必宁冲剂由白芍、当归、川芎、党参、肉桂、黄芪、莪术、元胡和牛膝等11味中药组成，全方共奏温经散寒、行气止痛之功。

2.1.2 对照组 安慰针+中药，为非经非穴位浅刺，选穴部位为试验组选穴旁开1寸，穴位皮肤浅层0.5 cm，刺破皮肤后不行手法，针灸针接电针仪，并连接电针仪特制的电源线电极(电源线一端切断作为特制电源线，外表与正常电源线一致；实则无电流输出)。

2.1.3 空白组 正常健康女性10例，不进行任何处置。

2.2 观察指标

对进组患者每次月经干净后2～3 d复诊，复诊时了解患者临床症状，如痛经、性交痛和盆腔痛等，且当日空腹、静息状态下采血5～7 mL，于黑龙江中医药大学附属第一医院实验室采用化学发光检测方法检测CA125。

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法检测血清VEGF、VEGFR，参照试剂盒说明书进行。获取的血液样本均进行离心，按要求在-80℃储存血清样本，获得所有血清后于本院妇科实验室进行统一检测。整个治疗期间共3次。

2.3 疗效评定

2.3.1 痛经疼痛程度评分标准 参照1993年版《中药新药治疗痛经的临床研究指导原则》[6]制定，月经期及其前后小腹疼痛计5分(基础分)；腹痛难忍计1分;腹痛明显计0.5分；坐卧不宁计1分;休克计2分；面色苍白计0.5分;冷汗淋漓计1分；四肢厥冷计1分；需卧床休息计1分;影响学习工作计1分；用一般止痛措施不能缓解计1分;用一般止痛措施疼痛暂能缓解计0.5分；伴腰骶疼痛计0.5分;伴恶心呕吐计0.5分;伴肛门坠胀计0.5分;疼痛在1 d以内0.5分(每增加1 d加0.5分)。分数越高代表疼痛程度越严重。轻度<7分，中度7～12分，重度>12～15分；在0、3个月经周期结束后进行评分。

2.3.2 中医证候疗效判定标准 参照2002年《中药新药临床研究指导原则》制定。采用尼莫地平疗效指数方法进行疗效评定(寒凝血瘀)。指数n=[(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分]×100%。①痊愈：治疗后各症状未再次出现，n≥95%；②显效：治疗后各症状明显减轻，70%≤n<95%；③有效：治疗后各症状有所减轻30%≤n<70%；④无效：治疗后各症状无减轻或有所加重，n<30%。

2.4 统计学处理

3 结果

试验组有4例患者因不耐受针刺疼痛及个人原因不能继续参与治疗;对照组5例患者因依从性不良，未按照规定服用药治疗，1例患者因意外妊娠不能继续参与科研自行退出中止治疗。最终共70例患者完成3个月的治疗观察。试验组36例，对照组34例。

3.1 两组患者治疗前后痛经、证候评分和CA125比较

治疗前两组患者痛经、证候评分和CA125比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示两组具有可比性。治疗后试验组患者痛经、证候评分、CA125与治疗前相比均显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；组间治疗后比较，试验组痛经、证候评分和CA125改善情况均优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者治疗前后痛经、证候评分和CA125比较

3.2 两组患者治疗后证候临床疗效比较

治疗3个月后，试验组总有效率91.67%，对照组总有效率76.47%。两组总有效率经统计学分析，，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明试验组的疗效优于对照组。见表2。

表2 两组患者治疗后证候临床疗效比较 [例(%)]

3.3 两组患者治疗前后血清VEGF水平比较

如表3，两组患者体内VEGF含量皆比空白组的健康人水平高，治疗后皆向健康人含量趋势靠近，试验组比对照组更显著。经3个月治疗后，两组血清VEGF水平均下降。分别行两组组内治疗前和治疗3月后比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。组间治疗前比较，差异无统计学意义(P>0.05)，表明两组具有可比性，组间疗后比较，差异有统计学意义(P<0.05)，表明试验组对降低VEGF值明显优于对照组。

表3 两组患者治疗前后VEGF比较

3.4 治疗前后血清VEGFR水平比较

如表4，两组患者体内VEGFR含量皆比空白组的健康人水平高，治疗后皆向健康人含量趋势靠近，试验组比对照组更显著。经3个月治疗后，两组血清VEGFR水平均下降。分别行两组组内治疗前和治疗3个月后比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。组间治疗前比较，差异无统计学意义(P>0.05)，表明两组具有可比性；组间治疗后比较，差异有统计学意义(P<0.05)，表明试验组对降低VEGFR值明显优于对照组。

表4 两组患者治疗前后VEGFR比较

3.5 随访

截止2019年11月30日，剔除本研究中脱落的患者，对剩余70例患者进行电话随访调查，追踪是否治疗后3个月后存在痛经复发情况。试验组复发率(13.89%，5/36)，对照组复发率(26.47%，10/34)，试验组复发率明显低于药物组。如表5。

表5 两组患者治疗后3个月痛经复发率比较

4 讨论

近年来，EMs一直是医学研究热点，目前对EMs发病机制尚未明确。发病学说也是众说纷纭，以Sampson最先提出的经血倒流种植学说为经典主流理论学说。该理论中认为随着逆流的经血，侵袭局部基质并种植在腹腔或其他部位的异位内膜组织，它能生存、生长并引起病变和造成一系列(痛经、性交痛和慢性盆腔疼痛等)症状，需要形成自身的血管网以获取营养物质。研究[11]也证实了脱落的子宫内膜在“落脚点”发生粘附、侵袭后，只有形成新生血管网才能为异位内膜细胞提供必需的氧份和营养物质，使EMs的生物学特性如肿瘤一样，因此它也常被称为“不死的癌症”。大部分学者认为[12]，异位病灶及其周围组织血管的异常增生是EMs主要发病机制，故认为新生血管的生成潜能是造成子宫内膜异位种植成活并如肿瘤一样发展的关键步骤，而抑制血管异常增生是目前临床研究该病的重点及热点。

血管增生在EMs发生发展过程中起着无可替代的重要作用。该过程是受到多种信号通路共同参与和影响的结果，其中最为重要的就是VEGF/VEGFR信号通路。VEGF及其受体VEGFR是一组迄今为止发现的公认作用最强、特异性最高的促血管生成因子。近年来有较多的实验结果提示：EMs的腹腔液中或异位内膜组织中以及在位内膜中检测VEGF蛋白的含量高于正常健康妇女的子宫内膜，提示EMs的发生与VEGF的过表达有很大关系。VEGF是一种结合肝素的二聚体糖蛋白，它可以特异性地直接与VEGFR受体结合，激活相关的下游蛋白反应，释放各种生长因子与细胞因子，在血管和淋巴管生成中起到直接或间接的调控作用，可促进周围的血管内皮细胞并诱导其增生，最终新生血管大量生成以及微血管通透性增加。血管通透性增加可导致血浆中纤维蛋白原的渗出，从而又加快了EMs患者的病灶内膜的修复以及生长[13]。VEGF的高表达还可使异位内膜具有很强大的血管增生能力，保证异位内膜的存活，使其不断出血和充血水肿，瘀血在腹腔内不断积累，从而引起盆腔疼痛、渐进性痛经、不孕及月经异常等症状[14]。

血清CA125在机体正常情况下，腹膜屏障只允许少量CA125抗原自腹膜腔进入血循环中，含量较低[15]，当EMs患者病灶组织种植侵袭并诱导子宫内膜移位，使腹膜层被损伤，与血管之间的屏障遭到破坏,导致大量的CA125进入到血液中引起血清CA125水平升高[16]。本观察中，EMs患者血清中CA125水平与正常健康人群相比明显升高，说明通过检测机体血清CA125浓度能够客观的作为辅助诊断EMs的一项重要指标[17]。但由于CA125特异性不高，且可因为卵巢或盆腔等其他病变而升高,因此需与其他指标共同进行鉴别诊断[18]。

明代武之望《济阴纲目·积聚癥瘕门》中记载：“善治癥瘕者，调其气而破其血，消其食而豁其痰，衰其大半而止。”故认为EMs所致疼痛需以调补冲任、活血化瘀之法为准则。本研究穴位的选择体现了“经脉所过，主治所及”的特点。采取局部与远端取穴方法，选取关元、气海、气穴、太溪、大赫、子宫穴和地机穴7个固定穴位。大部分中医家认为该病病位在冲任、胞宫，瘀血内停是本病的病理基础。关元、气海均位于腹部任脉之上，任脉起于胞中，针刺关元、气海两穴具有培元固本、补益下焦、通胞宫和调冲任之功。子宫穴为经外奇穴，位于下腹部，邻近胞宫，从人体解剖学可知其深部便是子宫及附件所在位置，故亦为治疗EMs之要穴，针刺该穴可调经理气。大赫是足少阴肾经与冲脉的交会穴，针刺该穴可增强补肾调经之力。气穴位于关元穴左右一指宽处，乃冲脉、足少阴之会穴。针刺气穴，增强调经行气、活血散瘀之效，从而达到止痛的效果。太溪为足少阴肾经的原穴、输穴，是气血所注之所。地机为足太阴脾经穴位，郄穴，经气深集，可止疼痛。全方选穴以任脉经穴作为主穴，通过补肾调冲任，调整机体阴阳气血平衡，使肾-天癸-冲任-胞宫生殖轴功能正常运行。电针作为一种非特异性刺激疗法，可激活机体自身的疼痛调节系统提高痛阈和耐痛阈发挥镇痛效果。电针可促使经络流通，“淚塞者去，闭滞者行”，结合现代医家对EMs造成痛经的研究认识，瘀血是EMs的基本病因，因此电针治疗EMs痛经可使瘀血去，癥块可消，气血流通，通则不痛。该穴位配伍可调补冲任、活血止痛及化瘀消癥。

古代医籍中其实并无EMs病名的记载。但根据其主要症状及体征，中医大多将其归属于“痛经”“癥瘕”“不孕”“性交痛”等范畴。《景岳全书》全面总结了癥瘕之证乃“瘀血留滞作症，……余血未净，而一有所逆则留滞日积，而渐以成癥矣”。正如异位内膜在女性性激素周期性作用下脱落出血，即为“离经之血”，此血及脱落的内膜均不能排出体外或及时吸收化解，则成瘀血，瘀血日久不去，血瘀更甚。《金匮要略》记载:“带下，经水不利，少腹满痛……土瓜根散主之。”指出瘀血阻滞，血脉不畅，不通则会致经行小腹胀痛，可采用活血破瘀通经之法进行治疗[19]。随着当代中医学家对EMs造成痛经的研究日趋深入，1990年，EMs在中医的诊断标准中被确定为“血瘀证”，成为EMs的基本病因病机。近些年临床研究认为，该病主以“血瘀”为基本发病原因，同时也有寒热虚实之分，与寒凝、气滞、热郁和痰湿等均有密切关系[20]。《医林改错》言：“血受寒则凝结成块”。特别是受东北寒冷的气候的影响，临床病证主以寒证居多。女性多素体阳虚，体质偏寒，机体温煦失职，阴寒内生，或感受外寒，或经期过食生冷，造成寒邪留滞胞宫，寒凝则血瘀，瘀血停留冲任，阻滞于胞脉，血不归经，妄行脉外，气血运行不畅，不通则痛，最终发为痛经。因此在临床上该地区以寒凝血瘀者尤为多见。本研究的中药使用的是本院院内制剂痛必宁冲剂，其由马宝璋教授根据《妇人大全良方》温经汤加减化裁而成。其中“温经汤”原方为治疗寒凝血瘀型痛经的经典方。痛必宁冲剂由白芍、当归、川芎、党参、肉桂、黄芪、莪术、延胡索和牛膝等11味中药组成，其中当归、川芎养血活血调经；肉桂温经散寒、通脉调经；黄芪、党参均具补气之功，助肉桂散寒；莪术、牛膝活血祛瘀，可助当归、川芎同行血滞;延胡索行滞、破癥癖和止痛，白芍缓急止痛。全方共奏温经散寒、行气止痛之功。现代药理研究认为官桂可能会抑制异位内膜细胞增殖，诱导凋亡，从而减轻内异症痛经症状[21]。当归配伍白芍能通过改善供血、减缓子宫平滑肌的收缩而达到止痛效果[22]，而且当归中含有的正丁基苯酞可抑制血管的生成，同时还可抗炎、镇痛，进而缓解疼痛症状[23]。黄宁江[24]研究发现川芎提取物川芎嗪对血管内皮细胞生长和增殖起到显著抑制作用且随着浓度的升高和作用时间的延长，其抑制效果越明显。牛膝提取物牛膝多糖可明显抑制异常细胞的生长，降低VEGF活性表达率[25]。

本临床研究结果显示，两组EMs痛经患者体内CA125、VEGF和VEGFR的表达明显高于健康人(均P<0.05)，提示EMs痛经发生可能与CA125、VEGF和VEGFR异常上调相关。经过3个月的治疗，观察两组患者痛经积分、证候积分、CA125、VEGF及VEGFR治疗前后组内及治疗后组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，试验组比对照组临床疗效及CA125、VEGF和VEGFR改善更佳。表明电针能够有效下调CA125、VEGF及VEGFR相关因子在患者机体内的表达水平，从而改善EMs痛经症状。电针可能通过抑制VEGF/VEGFR传导通路上的因子表达来实现治疗EMs痛经的目的。通过针灸调控VEGF/VEGFR信号通路机制治疗EMs痛经是未来需要我们继续探索研究的方向，临床研究者仍需要针对EMs血管生成机制进行深入研究，探索针灸治疗本病的作用机制，为针灸治疗EMs痛经提供新的方向、策略以及理论依据。