基于CyclinD1/CDK4/E2F1信号通路与氧化应激探讨艾灸治未病延缓大鼠子宫组织衰老的机制*

段浩茹，欧阳夏荔，金 琪，罗 雪，韩 丽△，赵百孝,赵思雨,张高钰,王中钰

(1.北京中医药大学，北京 100029； 2.中国中医科学院眼科医院，北京 100040)

子宫是女性产生月经、孕育胎儿和维持内分泌平衡的重要器官，但其衰老速度快于机体其他部位。一方面，子宫易受压力、不良生活习惯等因素的影响而衰老；另一方面随着年龄的增长，女性肾气、天癸渐衰、冲任渐虚和生殖功能逐渐减弱。子宫衰老不仅表现在大小、内膜的变化[1]，其功能亦逐渐衰退，进而引起内分泌紊乱，出现多种妇科疾病，使机体提前进入更年期[2]。“关元”穴艾灸不仅用于保健防病，还善于治疗生殖系统疾病，可调节子宫功能、延缓子宫衰老，但其机制尚未阐明。细胞周期阻滞与氧化应激参与衰老的发生发展，本实验以此为切入点，以12月龄Wistar雌性大鼠子宫组织为研究对象，对“关元”穴进行温和灸干预，应用酶联免疫吸附测定法检测相关指标，观察艾灸对细胞周期相关蛋白及机体抗氧化酶水平的影响，并分析两者的相关性，进而探索艾灸延缓子宫衰老的机理，最终为临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

本实验选取SPF级12月龄Wistar雌性大鼠14只，体质量(359.62±31.86)g，SPF级3月龄Wistar雌性青年大鼠7只，体质量(281.43±21.00)g。动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[许可证号SCXK(京)2016-0006]。于空气流通、自然光线充足、温度(24±2)℃和相对湿度30%～60%的条件下分笼适应性饲养1个月，若无不良反应，则纳入正式实验。适应性饲养及正式实验时期，动物自由摄食和饮水。

适应性饲养结束后，对大鼠进行随机分组。其中12月龄大鼠随机分为艾灸组和对照组，每组7只；3月龄青年大鼠7只为青年组。实验遵照国家科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求进行。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 试剂 大鼠细胞周期素D1酶联免疫试剂盒(Rat CyclinD1 ELISA Kit RGB& CHN Lot: 20190301.60482R);大鼠周期素依赖性激酶4酶联免疫试剂盒(Rat CDK4 ELISA Kit RGB& CHN Lot: 20190413.60481R);大鼠转录因子E2F-1酶联免疫试剂盒(Rat E2F1 ELISA Kit RGB& CHN Lot: 20190413.60513R)、超氧化物歧化酶测定试剂盒(Tatol Superoxide Dismutase Kit 南京建成&CHN Lot: 20181218);过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒[Catalase (CAT) assay kit 南京建成&CHN Lot: 20190410.40051]。

1.2.2 仪器 Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron全自动生化分析仪(美国)；Thermo Multiskan MK3(芬兰)。

1.3 干预方法

1.3.1 艾灸组 采用特制大鼠固定器固定大鼠，使其暴露穴位区域并保持清醒状态。穴位选取:参考《实验针灸学》[3]并结合大鼠骨骼及体型取“关元”穴，并对所有大鼠穴区直径1 cm左右区域进行备皮。将特制艾条(长约5 cm，直径约0.5 cm，河南南阳汉医艾绒有限公司)点燃后置于“关元”穴下方2 cm左右的位置，并在施灸过程中调整其与穴区的距离，以穴区皮肤微红、大鼠相对安静、无剧烈挣扎和嘶吼为度。每日1次，治疗20 min，连续40 d为1个疗程，疗程结束后取材检测相关指标。

1.3.2 对照组 与干预组进行同样的抓取与固定，每日1次，共40 d。

1.3.3 青年组 与干预组进行同样的抓取与固定，每日1次，共40 d。

1.4 指标检测

实验结束后，大鼠24 h禁食不禁水，按0.8 mL/100 g药量比腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉。麻醉后取大鼠子宫组织，于液氮速冻后冻存于-80℃冰箱备用。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠子宫组织中细胞周期素D1酶(CyclinD1)、周期素依赖性激酶4(CDK4)、转录因子E2F-1(E2F1)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的水平，实验过程严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 艾灸对各组大鼠子宫组织SOD、CAT含量的影响

与青年组比较，对照组大鼠子宫组织中SOD、CAT含量降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，艾灸组大鼠子宫组织中SOD、CAT含量上升，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 干预后各组大鼠子宫组织SOD、CAT水平比较

2.2 艾灸对各组大鼠子宫组织CyclinD1、CDK4和E2F1含量的影响

与青年组比较，对照组大鼠子宫组织CyclinD1、CDK4和E2F1水平均有所下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；而与对照组比较，艾灸组大鼠CyclinD1、CDK4和E2F1水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 干预后各组大鼠子宫组织CyclinD1、CDK4和E2F1水平比较

2.3 各组大鼠子宫组织CyclinD1与SOD、CAT的相关性分析

为探究大鼠子宫组织中细胞周期重要调节因子CyclinD1与子宫组织抗氧化能力是否有相互作用，在排除其他指标的影响后，对各组大鼠子宫组织中的CyclinD1与SOD、CAT含量分别做了相关性分析，结果表明，各组大鼠子宫组织中的CyclinD1与SOD、CAT均无相关性(P>0.05)。见表3～4。

表3 各组大鼠子宫组织CyclinD1与SOD的相关分析结果

表4 各组大鼠子宫组织CyclinD1与CAT的相关分析结果

2.4 CyclinD1/CDK4/E2F1通路作用机制

在G1期间，CyclinD1表达并与CDK4形成复合物，磷酸化激活Rb并使其与E2F1解离，游离的E2F1发挥转录活性促进细胞由G1期进入S期。见图1。

图1 CyclinD1/CDK4/E2F1通路作用机制示意图

3 讨论

女性子宫衰老伴随着形态结构及功能的逐渐衰退。子宫的生理功能与生理周期受肝、脾和肾的调节，其经脉可通过任脉联系于胞宫。关元是强壮之要穴，是任脉与足三阴经的交会穴，元阴元阳交关之所，具有内系元阳、藏精和维系胞宫等作用，为妇科疾病的常用穴。艾灸关元不仅能够固本培元、延缓衰老，还能补益下焦、调理生殖系统疾病。正如《扁鹊心书》记载:“人于无病时，常灸关元、气海、命门、中脘，虽未得长生，亦可保百年寿也”。又云:“余五十时，常灸关元百余壮，渐至身体轻健，羡进饮食，每年常如此灸，遂得老年康健。”由此可见，关元穴可作为保健灸的常用穴位。因此，本研究旨在观察艾灸“关元”穴对衰老进程中大鼠子宫组织的影响，进一步探究其抗子宫衰老的作用机制。

自由基的异常堆积是导致子宫衰老的重要因素。人体内含有低浓度的自由基，可维持机体氧化与抗氧化之间的平衡，参与机体的免疫防御。但随着年龄的增高，子宫组织清除自由基能力减弱，造成自由基的异常增多。自由基与含氧物质相结合发生氧化应激，进而可破坏细胞正常结构，加速细胞衰老。因此，降低自由基的氧化损害可延缓子宫衰老。过氧化氢酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)是机体清除自由基最主要的抗氧化酶，SOD负责将毒性强的自由基转变为毒性较低的H2O2，CAT则可清除SOD歧化反应与脂质代谢中产生的H2O2[4]。研究发现[5-7]，灸疗可提高衰老实验动物血清、骨骼肌和子宫等组织中SOD和CAT含量，促进自由基的清除，进而缓解组织老化。本实验利用酶联免疫吸附测定法研究艾灸对衰老进程大鼠子宫组织SOD、CAT含量的影响，结果发现，对照组大鼠子宫组织SOD、CAT含量明显降低，而艾灸可上调上述蛋白含量，提示艾灸可通过提高机体抗氧化能力来达到清除自由基、延缓衰老的目的。

衰老表现为机体细胞、组织生理功能渐进性退化，细胞周期停滞，细胞分裂增殖减慢。细胞周期包括分裂间期与分裂期，分裂间期由G1期、S期和G2期组成。细胞生长分裂过程中，必须经过G1期与S期之间的关卡调控点，而当细胞老化时细胞阻滞于G1期，无法进入S期[8]。G1/S期调控点受CyclinD1/CDK4/E2F1信号通路的调控。细胞周期素D1酶(CyclinD1)、周期素依赖性激酶4(CDK4)是G1/S期转化的正性调控因子，可加快细胞周期进程[9]。通过抑制CDK4活性可诱导细胞G1期阻滞和细胞衰老[10]。研究发现放射性脑细胞衰老模型CDK4表达减少[11]；衰老动物肠黏膜、子宫组织CyclinD1含量降低[12]。姚晖等[13]采用蛤蟆油灌胃治疗可显著提高CyclinD1蛋白含量，改善大鼠的衰老状态。E2F1同样是调控细胞周期的重要蛋白，其活性受视网膜母细胞瘤抑制蛋白(Rb)的调节[14]。E2F1与Rb结合时无法发挥作用，当Rb受CyclinD1与CDK4结合形成的复合物刺激时可磷酸化激活[15]，进而与E2F1解离，游离的E2F1则发挥转录活性从而使细胞完成G1/S期的转变[14]。作用机制见图1。研究发现衰老细胞中E2F1与靶基因结合减弱[16]。由Sirtinol诱导的早衰细胞中，Rb的磷酸化严重下调；但采用Sirtinol抑制剂处理后，细胞中E2F1活性明显增强[17]。以上研究数据表明，细胞衰老时细胞周期阻滞，E2F1与CDK4、CyclinD1表达减弱。

实验研究[18-19]发现艾灸可以降低G1期细胞比例，升高细胞的增值(PI)指数，使细胞顺利进入S期，进而延缓衰老。杜艳等[20]提示艾灸可促进Rb的磷酸化，抑制抑癌基因p16的表达，从而使停滞期的脑神经元细胞进入增殖期。p16基因又称衰老相关基因，与CyclinD1相拮抗，竞争性结合CDK4进而减弱CDK4/CyclinD1复合物的活性。故本研究提出假说，艾灸可通过调节细胞周期重要调节因子E2F1、CDK4及CyclinD1蛋白的表达，增加S期细胞比例，最终延缓子宫衰老。本研究显示，与青年组比较，对抗照组大鼠子宫组织中CyclinD1、CDK4及E2F1蛋白表达含量均明显降低，提示子宫衰老进程与细胞周期停滞关系密切；而经艾灸“关元”穴治疗后，大鼠子宫组织上述蛋白含量显著增高，实验结果表明艾灸“关元”穴可调节子宫组织CyclinD1、CDK4蛋白表达，促进E2F1的释放，使细胞通过G1期，进而对抗细胞衰老。

有研究发现[21]，骨髓衰老造血细胞增殖能力的下降，细胞周期的阻滞，衰老相关蛋白表达的上调，与骨髓基质细胞的氧化应激损伤密切相关，故推测氧化应激会抑制细胞增殖，参与衰老的发生发展。姚晖等[13]在蛤蟆油延缓衰老的实验研究中证实雌性衰老大鼠机体抗氧化作用以及自由基水平变化与CyclinD1、CDK4和pRb等细胞周期调控因子具有明显的相关性。因此，本实验在发现艾灸可提高衰老进程中大鼠子宫组织SOD、CAT含量和增强机体抗氧化能力的基础上，观察衰老进程中大鼠细胞周期相关蛋白与氧化应激损伤的关系，采用spearman法分析CyclinD1/CDK4/E2F1信号通路中起始分子CyclinD1蛋白表达情况与SOD、CAT含量的相关性，以进一步揭示艾灸延缓子宫衰老的具体途径。结果显示各组大鼠子宫组织中的CyclinD1与SOD、CAT均无相关性，与上述研究结果不符，进一步对其分析，原因可能有两方面。其一，艾灸延缓子宫衰老可能是通过调节自由基水平及细胞周期变化两条途径分别进行的，体现了艾灸多系统、多层面和多靶点的整体性调节特点；其二，本实验样本量不够充分，统计结果可能与大样本存在误差。

子宫衰老是一个综合性过程，其发生机制涉及广泛，而艾灸的抗衰老作用亦并非通过单一途径实现，因此研究应从单一学说逐渐发展为多学说的综合性、系统性研究，以便为艾灸的临床推广运用提供更加全面、可靠的科学实验依据。此外，艾灸发挥作用与灸量关系密切，在今后的研究中，应进一步探索艾灸时间、频率和疗程等是否会对艾灸疗效产生影响，从而保证实验严谨性。艾灸延缓衰老的时机同样是值得重视的问题，在大鼠青年期即采用艾灸干预，其抗衰老效果是否更加显著，笔者接下来的研究中将继续深入探讨。