菌藻共培养中有机碳对微藻生长的影响

贾伟，方志鹏，武发竹，李霞

（合肥工业大学 土木与水利工程学院，安徽合肥 230009）

近年来，藻华一直是困扰人类的环境问题，同时微藻也在生物柴油等各大领域都得到了应用[1]。微藻具有环境适应性好和光合效率高等优点，利用废水对微藻进行培养，不仅可以去除废水中的污染物，达到改善水质的目的，还可以将培养所得的微藻应用于工业生产中。但是相对细菌等微生物来说，微藻生长较为缓慢，如何提高微藻的生长速率是待解决的一大难题。本实验以小球衣藻和污泥细菌共培养为研究对象，通过测定微藻的生物量和培养液中氮磷的含量，探究有机碳在菌藻共培养中对微藻生长的影响，以期为藻华治理和污水处理等方面提供一定的指导依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小球衣藻（Chlamydomonas microsphaera），从中国科学院野生生物种质库-淡水藻种库（中国武汉）处购买，编号为FACHB-52；污泥细菌，取自合肥市朱砖井污水处理厂。

LIVE/DEAD染液（SYTO9染料0.33 mmol/L、碘化丙啶（PI）2 mmol/L），赛默飞世尔科技；黑色聚碳酸酯滤膜，上海力敏实业有限公司；丙酮、盐酸、氨基磺酸、抗坏血酸、钼酸铵、硫酸、酒石酸锑钾、葡萄糖、蔗糖，均为国药分析纯。

Centrifuge5804高速离心机，德国Eppendorf公司；BDP-250二氧化碳人工气候箱，上海百典仪器有限公司；IX73+DP倒置显微镜，日本Olympus公司；LX-650-L高压灭菌锅，合肥华泰医疗设备有限公司；UV2600紫外分光光度计，Unico（上海）仪器有限公司。

1.2 实验设计

实验环境为恒温光照培养箱内，实验条件的温度控制在（25±1）℃范围内，光照强度设置为2 000 lx，光暗比为12 h∶12 h。

实验组：准备4个体积为500 mL的玻璃锥形瓶[编号为1、2、3、4，内装有250 mL相同的且到达对数生长期的微藻（0.54×106cells/mL）]，向编号1、2、3、4锥形瓶中各加入2.4 mL的细菌（8.5×108cells/mL），保证初始的菌藻个数比约为15∶1。每天向编号2锥形瓶中加入0.01 g葡萄糖，向编号3锥形瓶中加入0.02 g葡萄糖，向编号4锥形瓶中加入0.05 g葡萄糖，同样将葡萄糖替换为蔗糖进行相同实验。

对照组：与实验组相比，除了不加入细菌，其余条件完全相同。

1.3 微藻生物量的测定

取10 mL样品于50 mL离心管中，在8 000 r/min下离心10 min，然后弃去上清液，将剩余物重新悬浮在10 mL的丙酮中，在4 ℃冰箱下避光保存24 h。最后再以8 000 r/min离心10 min，收集离心后所得上清液后，采用紫外分光光度法测定630 nm、645 nm、663 nm和750 nm波长下的光密度，空白对照为丙酮溶液，叶绿素a的浓度（μg/L）由公式（1）求得：

式（1）中：C（Chl-a）为叶绿素a的浓度，μg/L；V为提取体积，L；OD为λ波长处的光密度，nm[2]。

得到叶绿素a的含量后，再通过标准曲线将叶绿素a的浓度换算成微藻的细胞数。每个样品都需要3个相同的平行样品，以此减小实验所带来的误差。

1.4 硝态氮和总磷的测定

从反应器中取3 mL样品于5 mL的离心管中，再通过0.22 μm的滤头过滤后留作备测，取1 mL备测样品于50 mL比色管中，然后使用超纯水将备测样品稀释至标线处，先加入1 mL配好的1 mol/L的盐酸，再加入0.1 mL已配置好的8%的氨基磺酸溶液，分别在220 nm和275 nm波长处测量吸光度，硝酸盐氮的含量按公式（2）计算：

式（2）中：A220为220 nm波长下的光密度；A275为275 nm波长下的光密度[3]。代入公式（2）求得A校，再通过标准曲线查得A校所对应的硝态氮含量（mg/L）；再取1 mL备测样品于50 mL比色管中，然后使用超纯水将备测样品稀释至标线处，先加入1 mL配制好的抗坏血酸溶液，再加入2 mL已配制好的钼酸盐溶液，测定在700 nm波长下的吸光度[3]。再通过标准曲线中查得所对应的总磷含量（mg/L）。测试水样若之前经过稀释处理，则所测结果应乘以之前的稀释倍数。每个样品都需要3个平行样品，以此来减小实验所带来的误差。

1.5 细菌生物量的测定

细菌量的测定通过分子探针LIVE/DEAD细菌活性试剂盒来测定。具体操作过程为：取3 μL PI和3 μL SYTO9加入5 mL样品中，在室内避光30 min，将染色后的样品通过孔径为0.22 μm、直径为25 mm的黑色聚碳酸酯膜，在荧光显微镜下进行观察和拍照，在200倍下对同一样品随机拍摄10张照片，记录细菌数[4]。

2 结果与分析

2.1 不同有机碳浓度下微藻的生物量

不同葡萄糖和蔗糖浓度下微藻的生物量如图1所示。从图1中可以看出，不投加有机碳时，菌藻共培养中微藻的生物量略低于纯藻培养，说明无有机碳时细菌的存在对微藻的生长有略微的抑制作用；加入有机碳后，纯藻培养中微藻的生物量随着有机碳浓度的增加无显著变化，但菌藻共培养中微藻的生物量随着投加有机碳浓度的增加而显著增加，说明有机碳和细菌共同作用可以加速微藻的生长，如在每天投加有机碳0.05 g的条件下，菌藻共培养中微藻的生物量从第0 d的0.53×106cells/mL增加到第6 d的（3.37～4.62）×106cells/mL，且远高于纯藻培养组第6 d的0.93×106cells/mL。

图1 不同葡萄糖（a）和蔗糖（b）浓度下微藻的生物量

2.2 不同有机碳浓度下培养液中氮的含量

不同葡萄糖和蔗糖浓度下培养液中氮的含量如图2所示。从图2中可以看出，菌藻共培养对氮的降解效果优于纯藻培养，当添加有机碳后，氮的含量急剧下降，且随着有机碳浓度的增加，氮降解速率越快，第6 d氮的含量从第0 d的22 mg/L降低到2 mg/L左右，降解率达90%以上。实验结果表明，利用污水进行微藻培养，可以有效的去除培养液中的氮，对污水处理具有一定的指导意义。

图2 不同葡萄糖（a）和蔗糖（b）浓度下培养液中氮的含量

2.3 不同有机碳浓度下培养液中磷的含量

不同葡萄糖和蔗糖浓度下培养液中磷的含量如图3所示。从图3中可以看出，加入有机碳后，第1 d各组磷含量无明显变化，第2 d开始菌藻共培养对磷的降解效果优于纯藻培养，且随着有机碳浓度的增加，磷的降解效果提高，第6 d磷的含量从第0 d的48 mg/L降低到32 mg/L左右。磷的降解情况各组规律与氮降解情况类似，因此猜测磷的降解与氮降解存在着一定的关系，只有当氮水平降低到一定程度时，磷的降解才可以进行。

图3 不同葡萄糖（a）和蔗糖（b）浓度下培养液中磷的含量

3 结论

菌藻共培养时，有机碳对微藻生长有着极大的促进作用，且存在一定的量效关系。每天投加0.05 g的有机碳，在第6 d时，菌藻共培养中微藻的生物量从第0 d的0.53×106cells/mL增加到（3.37～4.62）×106cells/mL，是同条件下纯藻培养的3～4倍。在此条件下培养微藻，对氮和磷都有着不同程度上的降解，第6 d对氮的降解可以达到90%以上。