基于信息熵理论的地桃花叶醇提工艺优选及其化学成分的研究

韦正，张鹏，宁东元，宁廷婷，鲁世明，张晖英

（1.河池学院 化学与生物工程学院，广西河池 546300；2.韩山师范学院 化学与环境工程学院，广东潮州 521041）

地桃花为锦葵科植物肖梵天花（Urena lobataLinn.）的干燥地上部分[1]，是成方制剂花红片、花红颗粒、花红胶囊的主药之一[2]，在我国主要分布于福建、广东、四川、云南和广西等地区。地桃花主要含有黄酮、木质素、酚酸、挥发油类等成分[3]，其中以黄酮类成分为主，并含有银锻苷、木犀草素、芹菜素、山柰酚以及芦丁等化合物[4-5]。《中国植物志》记载其常用于治疗痢疾、急性肠炎[1]，具有抗炎[6]作用，也可用于治疗淋巴结结核[7]，对于利尿、解热、治疗风湿病或咳嗽均有效果[3]，且有利胆、强心的疗效[8]。广西和云南等少数民族地区以地桃花叶入药，地桃花具有抗氧化活性和广谱抗菌作用，且毒副作用较小。

地桃花叶中的黄酮为其主成分之一，而以银椴苷含量较高，可作为质量控制指标。在药理方面，银椴苷具有显著的降血糖和抗氧化等作用。本研究以银锻苷、总黄酮含量、DPPH自由基清除率为综合评价指标，采用正交试验及信息熵理论多指标综合加权评分法[9-13]，优化地桃花叶醇提取工艺，并筛选出最佳提取条件，以期为地桃花叶的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

地桃花叶购自广西宜州市中药材市场，经河池学院覃国乐副教授鉴定为锦葵科梵天花属植物肖梵天花的地桃花（Urena lobataLinn.）的叶。

1.2 试剂与仪器

磷酸、乙酸铵、三氯化铝、乙醇、甲醇、石油醚，分析纯，西陇化工股份有限公司；2,2-二（4-叔辛基）-1-苦肼基，分析纯，美国Sigma公司；乙腈，色谱纯，美国天地；芦丁（批号MUST-15091104）、银锻苷（批号MUST-16061202）对照品，纯度＞98%，成都曼斯特生物有限公司。

Shimadzu LC-20AT型高效液相色谱仪（SIL-20A自动进样器、SPD-20A检测器、LC solution色谱工作站），日本岛津公司；Agilent 8453紫外可见光分光光度计，美国Agilent公司；Millipore D-Q3超纯水一体机，赛恩斯仪器有限公司；ME204E型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；RE-52AA系列旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；WKH-1.7-A型热风循环烘箱，青岛市精诚医药装备制造有限公司；HH-S4型数显恒温水浴锅，金坛市医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 药材预处理

将地桃花叶适当剪碎，自然阴干，于50 ℃烘箱中恒温烘干后用粉碎机打粉，过80目网筛，再用石油醚（沸程60～90 ℃）回流脱脂，进行多次脱色至石油醚无色，过滤，药材于50 ℃烘干，装袋备用。

1.3.2 对照品溶液制备

称取适量银椴苷对照品，用甲醇溶解并稀释银椴苷质量浓度为0.033 mg/mL；称取适量芦丁标准品，加70%乙醇稀释成浓度为0.336 mg/mL。置于4 ℃的冰箱中保存，待用。

1.3.3 供试品溶液制备

称取地桃花叶样品粉末0.5 g置于圆底烧瓶中，加入75%乙醇60 mL，密塞，称定质量，于水浴锅回流提取90 min后，冷却至室温，称定质量，补重摇匀，提取液以0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.3.4 液相色谱条件

色谱柱：Inertsustain AQ-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：乙腈（B）、0.05%磷酸溶液（A）；梯度洗脱（0～5 min，15%～22% B；5～8 min，22% ～ 27% B；8～ 25 min，27% ～ 40% B；25～ 30 min，40% ～ 50% B；30～ 40 min，50%～100% B；40～45 min，100%～100% B）；流速：0.6 mL/min；检测波长：315 nm；柱温：30 ℃；进样器：10 μL。

1.3.5 线性关系考察

精密吸取 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、15 μL混合对照品溶液，按“1.3.4”项下的色谱条件测定。根据对照品浓度（C）和对照品峰面积（A）进行线性回归。

1.3.6 精密度考察

精密吸取对照品溶液10 μL，按“1.3.4”项下进样6次，测得银椴苷的峰面积，计算RSD值。

1.3.7 重复性考察

按照“1.3.3”项下制备6份供试品溶液，分别按“1.3.4”项下进样6次，测得银椴苷的峰面积，计算RSD值。

1.3.8 稳定性考察

取同一份供试品溶液，在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h分别通过液相色谱仪自动进样测定，测得银椴苷峰面积，计算RSD值。

1.3.9 加样回收试验

取待测液6份，精密分别加入一定量的对照品储备液，按“1.3.3”项下制备供试品溶液，分别按“1.3.4”项下进样6次，测得加样回收率，计算RSD值。

1.3.10 总黄酮含量测定

三氯化铝-乙酸盐法准确移取芦丁标准液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于10 mL的容量瓶中，加入70%的乙醇溶液至5 mL，加2 mL pH=5.5的乙酸铵缓冲液，之后加入4 mL 1.5%的三氯化铝溶液，用70%的乙醇溶液定容至刻度，充分摇匀，静置30 min后，在415 nm波长下测吸光度[10-14]。样品溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，依次测定总黄酮的含量。

1.3.11 DPPH自由基清除率的测定

现配0.02 mg/mL的DPPH溶液。精密移取0.5 mL待测样品溶液，加甲醇稀释至1 mL，再加入DPPH工作液6 mL，充分摇匀，在避免光照的条件下静置30 min，于517 nm处依次测量，按公式（1）计算清除率（I）[10-14]。

1.3.12 正交试验设计

如表1所示，设计四因素三水平试验，以温度、乙醇浓度、时间、料液比为要素，选择L9(34)正交表进行实验设计，2次平行试验，分别以地桃花叶中的银椴苷、总黄酮提取率、DPPH自由基清除率作为考察指标[10-15]，拟合信息熵进行评价。

表1 正交设计因素水平表（n=2）

2 结果与分析

2.1 高效液相指纹图谱

地桃花叶供试液按照“1.2.4”条件进样分析，银椴苷出峰时间为26.3 min，色谱峰分离度好，分离度大于1.5，色谱图见图1。

图1 银椴苷特征峰

2.2 方法学考察结果

银椴苷0.066～0.495 μg/μL内呈良好的线性关系，线性回归方程为Y=2 856 220.0141X+4 506.3798，R2=0.9998。精密度考察峰面积RSD为0.12%，表明仪器精密度良好；重复性考察峰面积RSD值为2.1%，表明方法重复性良好；稳定性考察峰面积RSD值为0.19%，表明供试品溶液在24 h稳定性良好。加样回收率试验中测得加样回收率为95.12%，RSD为1.4%。

2.3 正交实验结果

根据线性方程计算地桃花叶中银椴苷的含量、总黄酮的提取率以及DPPH自由基清除率，试验结果见表2。

表2 正交设计结果（n=2）

2.3.1 基于信息熵赋权的正交试验分析

经过对地桃花的银椴苷含量、总黄酮含量、自由基清除率的计算，根据文献给出的步骤[11-13]，建立以银椴苷含量、总黄酮含量和自由基清除率为指标的矩阵（X）：

将原始矩阵转换为概率矩阵(Pij)mn，其中，Pij表示第j次实验在i指标下的概率。根据公式（1）计算Pij，将初始矩阵转化为“概率”矩阵（P）：

计算各个指标的信息熵（Hi），将得到评价指标的（Hi）：

计算第i项指标的系数（Wi）:

综合评价指标Mm＝P1m×W1＋P2m×W2＋P3m×W3，即银椴苷含量、总黄酮含量、自由基清除率各指标的权重系数依次为0.0211、0.9668、0.0121。

2.3.3 正交试验方差分析

采用信息熵加权法对结果进行分析，结果见表3。从表3分析来看，影响提取效率的因素大小依次为A＞B＞D＞C，即温度＞浓度＞料液比＞时间。时间对结果没有显著性影响。综合结果分析可知，最优提取条件为A3B2C2D2，即回流提取温度为95 ℃，乙醇浓度75%，提取时间为120 min，料液比1∶60（g∶mL）。

表3 方差分析

2.4 验证实验

按正交实验最佳工艺条件，平行进行5份验证性实验，银椴苷的平均含量为0.118 11 mg/g，RSD值为0.12%；总黄酮的平均含量为25.27448 mg/g，RSD值为0.42%；DPPH自由基清除率平均值为为82.79%，RSD值为0.67%；综合评价指标M平均值为2.458 07，RSD值为0.37%。该结果与正交试验结果基本一致，说明此工艺稳定可靠。

3 结论

以地桃花叶为研究对象，引入信息熵对试验数据进行分析，以银椴苷的醇提得率、总黄酮的提取率、自由基清除率作为参考指标，采用正交实验设计对工艺参数进行了优化，并对工艺参数进行了评价。结果表明，最佳工艺参数为提取温度95 ℃，乙醇浓度75%，提取时间120 min，料液比1∶60（g∶mL）, 银椴苷的含量为0.11837 mg/g,总黄酮的含量为25.22430 mg/g。