单因素试验优选车前草中大车前苷的提取工艺

吴柱，陈乔杰，罗炳，魏丹丹

（长沙医学院，湖南长沙 410000）

车前草为车前科车前属植物车前或平车前的干燥全草[1]，具有清热利尿、通淋祛痰等功效[2]，车前草中含有大车前苷[3]、桃叶珊瑚苷、高车前苷、熊果酸、车前黄酮苷、车前草苷以及洋工香酚苷[4-5]等多种化学成分，2020版《中国药典》中以大车前苷含量作为车前草药材质量评价标准。本研究通过单因素试验优选车前草中大车前苷的最优提取条件，旨在为车前草开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

P1202型高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司；AL204电子天平，梅特勒-托利多公司；DF-101S恒温加热磁力搅拌器，巩义予华仪器有限公司；KQ300E超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂

大车前苷对照品，埃法生物科技有限公司，CAS号为104777-68-6；车前草，泰和中药饮片有限公司，批号为19081601；乙腈、甲醇，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、甲酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，分析纯，天津市化学试剂厂；纯化水，自制。

1.3 色谱条件

色谱柱WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸-水溶液；梯度洗脱（0～5 min，19%A；6～10 min，19%～25%A；10～15 min，25%A；15～20 min，25%～45%A，20～30 min，45%A）；波长：330 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

1.4 溶液的制备

称取大车前苷对照品10.03 mg，放入10 mL容量瓶中，加甲醇定容，得浓度为1.003 mg/mL大车前苷对照品溶液。

1.5 标准曲线的绘制

取大车前苷对照品溶液，置于10 mL容量瓶中，分别制成 50.15 μg/mL、100.30 μg/mL、200.60 μg/mL、401.20 μg/mL 和 601.80 μg/mL 对照品溶液，按“1.3”项下色谱条件进样，记录数据。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标得到线性回归方程为y=13.075x+32.838（R2=0.9992），大车前苷HPLC色谱图如图1所示。结果表明大车前苷在50.15～601.80 μg/mL浓度范围内线性关系良好，本方法可用于大车前苷含量测定。

图1 大车前苷HPLC色谱图

2 结果与分析

2.1 提取工艺单因素实验

2.1.1 溶剂种类考察

取车前草粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入溶剂20 mL，称重，超声提取30 min，放冷至室温，补足减失重量，混匀，过滤，按“1.3”项下色谱条件进样，结果见表1。由表1可知，以甲醇作为提取溶剂，车前草中大车前苷提取量最高，达1.025%，后续实验选用甲醇为提取溶剂。

表1 溶剂种类考察

2.1.2 甲醇浓度考察

取车前草粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，分别加入不同浓度甲醇溶液20 mL，按“2.1.1”项下提取、进样，结果见表2。由表2可知，以60%浓度甲醇作为提取溶剂，大车前苷提取量最高，可达1.765%，采用60%浓度甲醇为提取溶剂进行下一步实验考察。

表2 甲醇浓度考察

2.1.3 提取方法考察

取车前草粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入60%甲醇20 mL，称重，采用不同提取法提取30 min，冷却至室温，补足减失重量，混匀，过滤，按“1.3”项下色谱条件进样，结果见表3。由表3可知，采用回流提取对大车前苷提取效率最高，因此采用回流提取法进行下一步考察。

表3 提取方法考察

2.1.4 提取时间考察

取车前草粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入60%甲醇20 mL，称重，回流提取一定时间后，冷却至室温，补足减失重量，过滤，按“1.3”项下色谱条件进样，结果见表4。由表4可知，大车前苷随着提取时间的延长，提取量逐步增多，当提取时间为45 min时，其提取量不再随时间延长有明显差异，结合时间效率关系，故选用45 min作为最佳提取时间。

表4 提取时间考察

2.1.5 溶剂用量考察

取车前草粉末0.5 g，分别加入不同体积的60%甲醇溶液，称重，回流提取45 min后，冷却至室温，补足减失重量，过滤，按“1.3”项下色谱条件进样，结果见表5。由表5可知，随着溶剂用量的增加，大车前苷提取量也逐渐增加，当溶剂用量为30 mL和40 mL时，大车前苷提取量无明显差异，结合经济效益考虑，提取溶剂用量采用30 mL。

表5 溶剂用量考察

2.2 验证试验

取10倍量车前草粉末，置具塞锥形瓶中，按质量体积比1∶60（g∶mL）加入300 mL 60%的甲醇溶液，称重，回流提取45 min后，冷却至室温，补足减失重量，过滤，按“1.3”项下色谱条件进样，记录数据，结果见表6。由表6可知，6批样品大车前苷平均浓度为0.4192 mg/mL，RSD值为0.35%，表明优化得到的提取工艺稳定、可靠。

表6 样品含量测定表

3 结论与讨论

本次实验分别考察了甲醇、乙醇、水3种溶剂对车前草中大车前苷提取量的影响，提取溶剂为水时，所得到的大车前苷提取量低、杂质多，色谱检测结果不理想；采用甲醇作为提取溶剂时，所提取的大车前苷含量高于乙醇的提取量，故选择甲醇作为提取溶剂。

通过考察溶剂浓度、提取方法、提取时间以及溶剂用量对车前草中大车前苷提取量的影响，确定最佳提取条件为60%的甲醇作为溶剂，样品与溶剂质量体积比1∶60（g∶mL），回流提取45 min。通过验证试验可知，该提取工艺稳定、可靠。