磁性纳米气泡的超声和磁共振双模态造影

李斌，杨芳

(东南大学生物科学与医学工程学院，江苏 南京 210009)

0 引言

超声诊断技术由于具有安全、低成本且能实时等优势而被广泛应用。但是医用低频超声分辨率有限，不能很好地将肌肉组织和血管区分开,且难以观察到微血管[1]。磁共振诊断技术分辨率高，但对于血管的敏感性低[2]。所以超声和磁共振检测微血管时都需要使用造影剂来提高超声成像分辨率[3]。目前使用的超声造影剂通常是直径在10微米以下的气泡，利用微气泡对超声波的非线性效应实现与周围机体组织的区分，提供组织灌注成像方法[4]。而核磁造影剂主要使用的是小分子钆类螯合物和超顺磁性纳米颗粒。钆类磁共振造影剂用药剂量大，机体产生不良反应的风险高，而磁性纳米颗粒比钆类造影剂毒性更小，所以目前使用磁性纳米颗粒做造影剂有较好的前景[2,5,6]。

目前迫切需要研发一种在超声和核磁共振都能有优良造影效果的造影剂，且最好避免使用毒副作用大的材料。而磷脂类材料有较好的生物相容性，且有其两亲性结构(一端为亲水性头部和一端的疏水性尾部)，导致其可以在水相中进行自组装形成脂质体和磷脂气泡等结构[7,8]。与此同时形成的组装体内部可以装载颗粒(如脂质体内部可以装载药物)，或者膜壳表面进行其他颗粒的装载[9,10]。

本文使用磷脂材料制备成脂质纳米气泡，且进一步将磁性纳米颗粒装载到脂质膜壳上形成磁性纳米气泡，最终用以实现良好的超声核磁双模态造影效果。

1 实验材料

见表1。

表1 -1 实验材料

2 磁性纳米气泡的制备与表征

2.1 磁性纳米气泡的制备

将二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)，二棕榈酰磷脂胆碱(DPPC)，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[(羧基(聚乙二醇)2000](DSPE-mPEG2000)，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-amine)储备液按9∶1∶1∶1的摩尔比例进行混合，每100mL上述混合物中加3mL甘油作为气泡保护剂，取2mL混合溶液至体积为5mL的西林瓶中，再加入20-40μL浓度为2mg/mL的肉桂酸修饰的γ-Fe3O4磁性纳米颗粒(MNPs)、2μL浓度为5mg/mL的N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，在25℃下反应6h。密封后，将瓶中气体替换为SF6。水浴加热到60℃，5min后，插入注射器，通过反复挤压注射器的方式制备磁性纳米气泡(MNBs)。挤压完成后，放置在4℃环境中保存(MNBs结构如图1所示)。

图1 MNBs的结构示意图

2.2 磁性纳米气泡的形貌表征

将MNBs稀释5倍后，取20μL滴加在硅片上自然干燥后使用扫描电镜(Ultra Plus S4800，Carl Zeiss，德国)对其进行形貌表征；取20μL滴加在铜网上自然干燥后使用透射电镜(JEM-2100，JEOL，日本)对其进行形貌表征；取20μL滴加在载玻片上并使用光学显微镜(Ti2-U，Nikon，日本)观察MNBs的膜壳形貌和其表面是否包覆MNPs。

2.3 磁性纳米气泡的粒径、浓度的表征

粒度电位分析仪(Zetasizer Nano ZS90，Malvern，英国)可以测量纳米颗粒的粒径和Zeta电位。由于纳米颗粒表面带有电荷会形成如同胶体表面的电荷水电层，因此，纳米颗粒表面会出现与颗粒表面电荷相反的紧密吸附层，在其外层会出现扩散层，扩散层中两种电荷的离子都存在，但是两种离子的量会有不同，与纳米颗粒表面同电性的离子数量会较多，因而该层中的总体电性会与纳米颗粒表面的电性相同，所以Zeta电位是测量纳米颗粒扩散层中的电位(如图2)。

图2 Zeta电位的测量示意图

使用粒度电位分析仪测量MNBs的粒径，取50μL的MNBs加入粒径皿中再加入950μL超纯水稀释到1mL，测量3次取平均(参数选择为：溶液选择water，材料选择lipid，温度25℃，预热120s，循环次数为15次)。再取800μL原液加入电位皿中测量电位(参数选择为：选择溶液选择water，材料选择lipid，温度选择25℃，预热时间选择120s，循环15次)。

贝克曼库尔特粒径仪(Multisizer4e粒径分析仪，Beckman Coulter，美国)是通过纳米颗粒通过小孔时引起的孔两端电极的电导率变化来测量纳米颗粒的浓度和粒径的大小，测量时测量杯中的部分待测液体吸入小孔内部，由于颗粒通过小孔时是单个通过，所以可以通过电流的每一次变化记录下通过小孔的颗粒数，将此颗粒数除以吸入的待测液体的体积即为该颗粒的浓度值。并且由于不同大小的颗粒通过小孔时引起的电导率变化不同，所以也可以得出不同粒径颗粒的分布情况。

使用贝克曼库尔特粒径仪测量磁性颗粒的浓度，选用20μm的小孔管测量磁性纳米颗粒的粒径，样品加入量为20μL。

图5 MNBs的粒径电位和浓度表征

图6 MNBs的不同比例稀释后的超声造影图像结果

2.4 磁性纳米气泡的超声造影

2.4.1 磁性纳米气泡的对比超声浓度探索

制作超声体膜：膜琼脂、甘油和超纯水按3:4:90的质量比例称量，在2L的烧杯中加热至90℃以上，连续使用玻璃棒缓慢搅拌混匀30min以上，至溶液变得透明无结块或无团聚出现，将液体倒入容器中并在其中固定好1.5mL离心管作为样品孔，冷却过夜后倒出整块体膜。

使用超声设备(Vevo2100小动物超声影像系统，Visual Sonics，加拿大)对普通磷脂气泡和磁性纳米气泡进行体外超声影像表征，超声参数为18MHz，25dB，30% power。先对磁性纳米气泡进行不同比例的稀释，以寻找合适的超声造影浓度(按照8倍，16倍，32倍，64倍，128倍和256倍的比例对磁性纳米气泡进行稀释)，对不同稀释比例的磁性纳米气泡进行超声对比造影(Contrastmode)。

2.4.2 磁性纳米气泡的超声信号的时间变化数据采集

选择16倍稀释后的MNBs进行对比超声造影，在造影增强区域中选取部分超声造影区域(ROI)，读取对比超声造影的信号数值，按照时间变化进行采集，每次采集间隔时间为2.5min进行超声数据采集，每次采集18s的超声信号，超声参数为18MHz，25dB，30% power，使用纯水作为对照。

2.5 磁性纳米气泡的核磁共振造影

将磁性纳米气泡进行不同比例的进行稀释(按照原浓度，8倍，16倍，32倍，64倍，128倍和256倍的浓度对磁性纳米气泡进行稀释)装入1.5mL离心管中，使用7T磁场的核磁共振仪(Biospec7T/20USR7.0T小动物核磁核共振成像系统，Bruker，德国)进行核磁成像进行T1核磁造影成像，TE为8.9ms，TR为400ms，FA为90°。并采用纯水和磷脂溶液作为对照组。使用相同的稀释比例对磁性纳米气泡进行了T2造影成像，TE为80ms，TR为2200ms，FA为90°。

3 实验结果

3.1 磁性纳米气泡的形貌表征结果

如图3所示，在扫描电子显微镜的图像中，MNBs整体形态呈现出球形，其膜壳表面粗糙且附着有约10nm的磁性纳米颗粒，扫描电子显微镜中的MNBs的直径约700nm。而在透射电镜图像中可以观察到磁性纳米颗粒大致形状为一个圆形，边缘为磷脂膜壳，在膜壳上同样可以看见许多磁性纳米颗粒吸附，这进一步表明MNBs膜壳表面有磁性颗粒聚集。同时透射电镜图像中能看出中心的气体核心部分，且在光学显微镜明场的图像中，MNBs呈现出亮的圆环,其中心较为透亮(其中心为气体核心)。磁性纳米气泡的扫描电子显微镜、透射电子显微镜和光学显微镜结果共同说明了MNBs具有外部的膜壳结构和中心的气核，且磁性纳米颗粒装载于MNBs的膜壳上。

图3 MNBs的形貌表征

3.2 磁性纳米气泡的粒径、浓度的表征

根据粒径表征结果可以看出，MNBs粒径为(785.7±26.5)nm， 分散系数(PDI)为0.353，MNBs的Zeta电位为-22.7mV，MNBs的浓度为2.00×108个/mL。由浓度表征结果可知MNBs的粒径主要是1μm以下，粒径在1μm以上的数量较少，说明MNBs尺寸主要为纳米级。

3.3 磁性纳米气泡的超声造影结果

从磁性纳米气泡各个浓度的超声造影结果中可以看出8至16倍稀释时(浓度约为1.25～2.5×107个/mL)有较好的超声造影效果，相比于纯水可以观察到明显的超声造影差异。但是稀释16倍以上时，浓度的降低会导致磁性纳米气泡的造影效果降低，最终不能形成一个完整的圆形。所以本实验所制备的磁性纳米气泡的最佳造影稀释浓度为稀释8至16倍。

选择16倍稀释的MNBs浓度(1.25×107个/mL)进行超声的时间扫描，每隔2.5min进行数据结果的记录，由超声数值结果可知磁性纳米气泡与纯水的超声造影在数值上存在明显差异，纯水数值较低且基本保持不变，而MNBs的超声数值信号较大，随时间延长超声数值缓慢降低。

3.4 磁性纳米气泡的核磁共振造影效果

由于病变组织在T1成像较暗，所以使用的T1造影剂提高成像亮度才能增强造影，所以需要比纯水的图像亮[2,3]。而病变组织与正常组织在T2成像都较亮，所以T2造影剂使病变区域变暗才能突出区别，所以需要比纯水的图像暗[2,3]。MNBs稀释到合适的倍数时能增强T1造影成像效果。本实验发现T1造影时8至16倍为合适的稀释倍数，此时MNBs(1.25～2.5×107个/mL)成像亮度比纯水亮，有T1造影增强效果。当T2造影时，加入不同浓度的MNBs成像都比纯水暗，所以MNBs有T2造影增强效果。

图7 MNBs的对比超声时间变化数值结果

图8 MNBs的核磁共振造影效果

4 总结与展望

本文成功制备了超声和核磁共振双模态造影的磁性纳米气泡，并且通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜和光学显微镜观察到了其颗粒包覆的膜壳和气体核心的结构。并测定了磁性纳米气泡的粒径和浓度，确定了其粒径为纳米级别。最后进行了超声和磁共振造影,结果发现，8至16倍的浓度稀释可以有较好的超声和T1的核磁成像效果，而不同浓度稀释的磁性纳米气泡都有较好的T2造影效果。

在后续的实验中如果能够增加一些其他的纳米颗粒如金纳米颗粒，就能进一步制备超声、核磁和CT的三模态造影增强剂。而目前的多模态造影剂需要进一步研究如何利用更廉价的材料或者提高材料的利用效率和造影效果，从而实现降低单瓶造影剂的售价。